实验指导-《分子生物学大(综合)实验》 2实验指导-《分子生物学大(综合)实验》 2.doc

《分子生物学大（综合）实验》实验指导 不同生长期仿刺参性腺组织中基因差异性表达的研究 幼参的性腺颜色一般为灰褐色，而成熟期，雌性生殖腺为橘红色，雄性为乳白色或浅乳黄色。 一、TRIZOL试剂盒提取RNA 取新鲜健康的体长为3-5 cm 的幼参与12-15 cm 的成熟参，用无菌海水清洗其体表，置于无菌大培养皿上。解剖刺参，取出其性腺。以幼参的性腺提取物为对照组，成熟刺参的性腺提取物为试验组。 1 匀浆 每50~100mg组织，加1ml的TRIZOL。将样品放在干净已灭菌的研钵中，倒入液氮，迅速研磨样品，在研钵中直接加入TRIZOL。样品的体积不要超过TRIZOL试剂体积的10%。再用Tip头吸到EP管中。 2 离心 匀浆后，2~8℃，12 000r/min，离心10 min。取上清，去沉淀。若上清顶层有一层脂肪，应去除。将上清液移到干净的EP管中，添加氯仿，相分离。 3分离 上清液在15~30℃下温育5 min，彻底去除核蛋白复合物。每1ml的TRIZOL试剂加0.2ml的氯仿，盖紧EP管盖。用手剧烈震荡15sec，15~30℃下温育2~3 min。2~8℃下，不超过12 000r/min, 离心15 min。离心后，复合物分离出从下到上依次为：一较低的红色区、酚氯仿相、一个分界面和无色上清水相。RNA保留在无色上清水相中，水相体积大约是用于匀浆的TRIZOL试剂体积的60%。 4 RNA沉淀 将上清液移到干净的EP管中，通过混合异丙醇使RNA沉淀。在匀浆初始使用的TRIZOL试剂量，每1ml的TRIZOL，加入0.5ml的异丙醇。混匀以沉淀RNA。15~30℃下温育10 min。2~8℃下，不超过12 000 r/min，离心10 min。RNA沉淀在离心前不可见，离心后形成一胶状颗粒，粘附在管的侧面和底部 5 RNA的洗涤 去掉上清，用75%乙醇洗沉淀。每1ml的TRIZOL（开始时），加入1ml 75%的乙醇，混匀样品，7 500 r/min，2~8℃，离心5 min。 6重溶RNA 去掉上清，使RNA沉淀风干或自然干燥，千万不要让RNA沉淀完全干燥。用不含RNAase的水溶解RNA（如用100μl DEPC水溶解RNA）。55~60℃下温育10 min。 7保存 分装后-70℃保存（DEPC水中）或-20℃条件下溶于75%的乙醇中。避免反复冻融。 注意： 1）实验用玻璃管、EP管→1‰DEPC水浸泡12h→湿热灭菌，110℃，30min，再放50℃烘箱中烘干备用。 2）镊子、剪刀等1600℃，120min。 二、分光光度法和RNA变性电泳法测定RNA浓度和质量 1 分光光度法检测RNA浓度 使用法玛西亚公司的DNA/RNA浓度测定仪，测定样品A260和A280值。根据A260/ A280比值，估测RNA质量。一般A260/ A280比值在1.8~2.0之间，可以满足实验要求。在100μl RNA原液中取1μl稀释至250μl（DEPC处理的水），测定样品的A260和A280的值，按下列公式计算其浓度：RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（ng/μl） 测定 RNA浓度按以下步骤进行操作： ⑴ 取1μl RNA原液，放在0.5ml EP管中，加入249μl dd H2O，用移液枪反复混匀。 ⑵ 用dd H2O为空白对照，调节A260零点。 ⑶ 倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A260值。倒掉比色杯中的RNA样液，用dd H2O冲洗比色杯，再调节A280零点。 ⑷ 倒掉比色杯中的水，加入稀释并混合均匀的RNA样液，测定A280值。计算A260/ A280比值，比值≥1.8，满足实验要求。 ⑸ RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40（ng/μl） 2 RNA变性电泳法检测RNA质量 采用RNA变性电泳法检测RNA质量,方法如下: ⑴ 凝胶制备： 制备1.2%琼脂糖凝胶（电泳槽体积为50ml） ① 称取0.6g琼脂糖，加入43.5ml水，加热溶解并降温到60℃。 ② 加入5ml 10×甲醛变性电泳缓冲液，并加入1.5ml 37%的甲醛，混合均匀。 ③ 倒入电泳槽中制胶（甲醛有毒，制胶应在通风橱中进行）。 ⑵ RNA模板准备（5~7.5μg total RNA） ① 制备如下混合液 （9.7μl） 10×甲醛变性电泳缓冲液： 1.25μl 37%的甲醛： 2.2μl 甲酰胺： 6.25μl ② 加入2.8μl RNA，使总体积达到12.5μl ③ 混合后离心5~10 sec（1 000~2 000 r/min