细胞生物学研究方法过程稿.ppt

体视荧光显微镜 用途： 1、活细胞荧光标记蛋白的长时程失踪观察 2、活细胞运动分化形态示踪观察 3、荧光共定位 4、荧光共振能量转移（FRET） 5、荧光图像处理、测量 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 ?原理及应用： ?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； ?实现对细胞内生物大分子进行动态研究和追踪。 ?步骤： ?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） ———放射自显影 ? 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry） ?利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 ? 流式细胞仪（Flow Cytometry） ?主要应用： 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。 流式细胞术 ? 细胞的培养 ? 细胞工程 ? 动物细胞培养 ? 类型：原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） ? 细胞系（cell line） 有限细胞系，永生细胞系 ? 细胞株（cell strain） ? 植物细胞 ?类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） ? 非细胞体系（cell-free system） 细胞悬浮液 10代细胞 50代细胞 无限传代 原代培养 传代培养 细胞系 有限与无限细胞系 如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？ 多数组织细胞固定在表面生长和分裂。 随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖 遗传物质改变 Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养 获得细胞 细胞的全能性 细胞株、细胞系 植物体 培养结果 或细胞产物 快速繁殖、培育无病毒植株等 培养目的 葡萄糖、动物血清 蔗糖、植物激素 培养基特有成分 液体培养基 固体培养基 培养基性质 细胞增殖 原理 动物细胞培养 植物组织培养 比较项目 植物细胞和动物细胞培养的比较 动物细胞培养技术的应用 （1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干 扰素、单克隆抗体等。 （2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。 （3）用于检测有毒物质 （4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据 这只老鼠身上的“人耳”是由我国科学家曹谊林教授利用细胞工程技术复制出来的。 ?细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 ?单克隆抗体（monoclone antibody）技术 ?细胞拆合与显微操作技术 ?物理法结合显微操作技术(图1、图2) ?化学法结合离心技术 ?制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。 ?其它技术 遗传分析（mutant, knock out, knock in） 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 主要用于制备 单克隆抗体 获得杂种植株 用 途 物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒 物理（离心、振 荡、电刺激） 化学（聚乙二醇） 诱导方法 使细胞分散后诱 导细胞融合 去除细胞壁后诱 导原生质体融合 细胞融合的方法 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性、 植物细胞全能性 细胞融合的原理 动物细胞融合 植物体细胞杂交 比较项目 比较项目 （一）植物、动物细胞融合的比较 细胞融合 单克隆抗体技术 (二)单克隆抗体 提出问题：长期以来，人们为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。 单克隆抗体的概念 （1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？ 思考： （2）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞 工程技术手段？ （3）制备过程为何要经过两次筛选？ 主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点。如；各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别“自己”与“异己”，一旦发现 致病因素便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。 绝大多数的单克隆