微生物之微生物多样性分析-DGGE微生物之微生物多样性分析-DGGE.pdf

变性梯度凝胶电泳 （PCR-DGGE） 普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移 率不同而分离不同的 DNA 片段，对于片段大小接近或相同的 DNA 片段无法做到有效 地分离；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶电泳， 是利用 DNA 在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从 而将片段大小相同而碱基组成不同的 DNA 片段分开。 DGGE 作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学 （土壤、海洋、河 流、冰川、淤泥等）、医学 （各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体 （鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。 实验流程图： 实验结果 实验结果包括以下内容 1 引物设计 以下是DGGE 中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。 引物 序列 （5’-3’） 细菌 357-F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG 16S V3 区扩 GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 增引物 518r ATTACCGCGGCTGCTGG 引物 序列 （5’-3’） 真核 Euk1A CTGGTTGATCCTGCCAG 18S V1-3 区 EukA516r-GC CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA 扩增引物 CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC 2 基因组 DNA 抽提电泳检测图 针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效 果最佳。 说明：1-8 为样本所抽提基因组 DNA，上样量 3uL；M 为 1kb Marker 上数第一条带为 8 kb，中间的亮带为 3kb，浓度为 30ng/uL，其余为 10 ng/uL。 3 目的片段PCR 检测 说明：1-8 为样本，负为负对照 （说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关 重要的），上样量为 5uL；M 为 DL2000 Marker，上样量 3uL。其中亮带为 20ng/uL， 其余为 10 ng/uL。 Reconditioning PCR： 第一轮 PCR 产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮 PCR 扩增，这叫做 “Reconditioning PCR”。由于在 “ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之 间的比例始终保持在较高的水平上，因此可以保证引物与模板之间的退火要优先于 不同模板之间的退火，消除异源双链 （Heteroduplex）污染对于 PCR-DGGE 图谱的观 察和分析。 参考文献： (1)Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by “reconditioning PCR”. 2002. Nucleic Acids Research. (2)不同外源扰动因素对肠道菌群组成结构影响的研究. 上海交通大学 2008 届博 士学位论文. 4 DGGE 图谱分析 4.1 DGGE 胶图和条形图 4.2 戴斯相似性系数 图注：lane:代表样品编号 4.3 微