各種疾病的分子基礎.ppt

各種疾病的分子基礎 檢測DNA質變的方法 單基因突變的檢測方法 物理特性 DGGE變性梯度明膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis PCR產物跑電泳的分析方法 瓊脂凝膠電泳：可知大略大小、但長度差異小無法分別 聚丙烯醯胺凝膠電泳：差一兩個鹼基可分開 電泳的速度與片段大小有關，跟DNA 的組成及序列無關，不能分辨鹼基之間是否有突變 DNA雙鏈上發生部分的解鏈，會使電泳速度大大減慢 DNA被變性的難易程度與DNA的長度及組成排列有關 片段長及CG-rich需較高的溫度 DGGE的基本原理 雙鏈的DNA部分解鏈成單鏈時，在凝膠電泳速度會大大減慢 有鹼基發生突變時，正常與突變跑出來的速度就會不一 樣 DNA解鏈的溫度還與凝膠中尿素或甲醯胺的濃度有關，濃度會改變電泳速度 DNA雙鏈的解鏈常是一個小區段接著一個小區段發生，這種小區段稱為變 性區 變性區有微小的改變，會改變電泳的速度，藉由電泳的不同將正常與突變檢測出來 變性梯度即尿素或甲醯胺的濃度，從陰極向陽極逐漸增強 解鏈強度較低的DNA片段先達到其變性梯度而解鏈，電泳速度減慢 解鏈強度高的DNA片段保持原來的速度繼續前進，直到達到特定變性梯度區才減慢速度 結果將長度相同而序列有差別的DNA片段分離 使用溴化乙錠或銀染就 可以觀測區帶的變化 設計PCR引子時，擴增片段只含一個變性梯度區 引子的5‘端增加20～40 bp左右的CG，即CG clamp，可讓DNA區充分解鏈 有時單個鹼基的替換無法改變解離強度 將PCR後的兩個檢體產物混合，加熱變性，然後緩慢降溫使形成雜合雙鏈，雜合雙鏈在突變部位形成錯配 雜合雙鏈的變性溫度與純合雙鏈有明顯的差別，雜合雙鏈能顯示出突變的存在 一般DGGE使用polyacrylamide gel（含尿素甲醯胺的濃度梯度 也可改成溫度梯度，稱為TGGE 固定變性凝膠電泳CDGE (constant denaturant gel electrophoresis) DGGE的缺點 引子設計複雜 必須只有單一的melting domain 較難控制電泳條件 PCR為基礎的相關技術 ARMS (Amplified refractory mutation system) 設計一對Primer可以特異地跟正常或突變的對偶基因結合 Allele-Specific PCR可用來檢測單鹼基的突變或微小缺失突變 缺點：突變與正常的基因型要分開來做， 不能同時在一管中進行 1993 Rust et al.建立MS-PCR (Mutagenically separated-PCR) 在正常(或突變)的引子5端多加了20 bp 以Primer長度不同或不同螢光染料來區分 靠近3‘端多加一、二個mismatch的鹼基，以增加反應的特異性 多個鹼基的改變會使引子與正常或突變序列結合的穩定性不同，這樣就增加引子的特異性。 設計三種引子，第一種是針對正常基因設計的短引子，第二種是針對突變基因設計的長引子，第三種引子則是共用的互補引子短片段者為正常型，為抗緊迫豬，而僅有長片段者為突變型，為緊迫豬，同時具有長和短兩個片段者則為雜合型，各具有一正常和突變基因，外表型表現與抗緊迫豬同 ACRS (Amplified Created restriction site) 偵測鹼基變異沒有產生限制酶切位時 設計一個與正常有一、三個鹼基差異的mismatch primer 此primer設計在變異的鹼基附近 PCR後，其產物在primer上的mismatch鹼基及鄰近序列合併變異的鹼基即可產生限制酶的切位 設計一個mismatch的primer來產生二種不一樣的PCR 產物，一種產物會被特定的限制酶切，另一種不會被切 Mismatch base的互補關係較不穩定，設計不佳沒有產物，若溫度調降雜bands多，特異性不足 應用ACRS時， Primer的設計就必須特別注意base互補的穩定性。要愈穩定愈好 多重PCR (multiplex PCR) 當DNA有大段缺損時，利用位於缺損部位的特殊標記，設計引子放大這些標記 設計時將每個標記的PCR產物設計成大小不同，且可在同一種PCR狀態進行作用 由結果產物的大小變化，即可了解缺損的部分及範圍 可用於偵測多個點突變 設計多組 Primer ，做PCR反應，將所有可能突變的位點或基因多個缺失熱點區，都擴增分析 注意各primer pairs之間應具有相同或相近的擴增條件，相互間不產生非特異性擴增或primer-dimer的情形 各個產物片段長度要適當，必須做 一個正常的內對照組( positive control)以防止擴增的假陰性反應 SSCP單鏈構形多形性single strand conf