140711 miR21 Realtime PCR 检测报告.doc

Realtime PCR 检测技术 【实验耗材】 1、移液枪：1mL、100μL、10μL。酒精擦拭，头部重点，紫外线照射。 2、吸头：1mL、100μL、10μL 3、EP管：1.5mL、100μL 4、铝制饭盒 【实验仪器】 天平、振荡器、高速离心机、0.5～10uL、10～200uL、100～1000uL加样器。 【自备试剂】 DEPC(焦碳酸二乙酯)，二甲苯，无水乙醇，0.1％DEPC－H2O。 实验准备： 【器具处理与准备】 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，小枪头需打入DEPC水，室温过夜，高压，烤干备用。 二、 样品的miRNA抽提 样品中miRNA抽提参照QIAGEN说明书（miRNeasy FFPE Handbook） 三、 RT (All-One miRNA qRT-PCR Reagent Kits，广州复能基因) 1、按下列组份配制RT反应液 5×PAP/RT Buffer 5 μL RTase Mix 1μL 2.5U/ul Poly A Polymerase 1μL Total RNA 18μL Total Up to 25μL 2、反转录反应条件如下: 37℃ 60 min，85℃ 5 min。 3、反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。 四、 qPCR (All-One miRNA qRT-PCR Reagent Kits，广州复能基因) 1、按下列组份分别配制Realtime PCR反应体系，以下是每一孔20μL 。 2×All-in-One qPCR Mix 10μL All-in-One miRNA qPCR Primer(2μM) 2μL Universal Adaptor PCR Primer(2μM) 2μL DNA模板（1：5稀释） 2μL 50×ROX Reference Dye 0.4μL dH2O(灭菌蒸馏水) 3.6μL Total 20μL 用漩涡振荡器将管中溶液彻底混合均匀，短暂低速离心。 2、点样,将步骤1中混合好的液体加入孔板中，每个样本的每个基因保证3个复孔,点完样之后将PCR板置于离心机中2000rpm、2min，然后用锡箔纸将板包好，置于4℃冰箱中备用。 引物设计