胰腺干细胞及其分离培养.docxVIP

胰腺干细胞及其分离培养随着临床同种胰岛移植治疗糖尿病在近年取得的突破性进展，对胰岛移植治疗的需求日益增多，而供者的严重短缺制约了同种异体胰岛移植的广泛开展。解决供者短缺的两条可能的途经之一是利用异种供者如猪的组织或器官，但目前仍有如前所述的诸多总问题尚未解决，近年内恐难在临床应用。另一条解决供者短缺的有效途经则可能是在体外大量培养可用于移植的细胞和组织。近20年来，人们注意到胰腺的某些肿瘤细胞具有永生性，即在一定条件下可以不断复制、增殖和分化。因而有研究试图在体外培养并改造这些细胞，使之可在体外大量增殖和培养传代形成一定的细胞系。然而，由于对这些细胞内在的增殖、分化调控机制的认识尚不够深入，因而这类细胞系有的在植入动物体内后难以调控其增殖及分化，可能形成肿瘤，而有些细胞系则在培养传代过程中逐渐失去了它们在正常生理条件下应有的如合成、分泌胰岛素等功能。胰腺在其胚胎发育过程中，胚胎胰腺上皮细胞增殖继之分化形成胰腺内的三种类型的细胞：内分泌细胞、腺泡细胞和导管上皮细胞[9]。在人和啮齿类动物实验中已证实这些细胞的共同祖细胞（progenitor）具有导管上皮细胞的表型，即角朊素细胞19（Cytokeratin-19， CK-19）或角朊细胞素20（Cytokeratin-20， CK-20）[10，11]。近10年来，可以通过在体外培养外分泌细胞，从而获得成人胰腺内具有导管上皮表型且有增殖潜能的细胞[12，13]。Langerhans胰岛有4种细胞组成，即可合成激素肽的细胞：1、产生胰岛素的β细胞；2、产生胰高血糖素的α细胞；3、产生生长抑素的δ细胞；4、产生胰多肽的PP细胞。它们在胰岛内有一定的立体位置和次序，与神经细胞紧邻。胰腺干细胞存在于胚胎及成年胰腺内，尽管胰腺和中枢神经系统具有不同的起源和功能，但控制这两个器官发育的机理都非常相似[14-16]。胰岛素促进因子（insulin promoter factor l , IPF-1）亦称（pancreas duodend homeobox 1 , PDX-1 ）是一种主要局限于成年胰腺已分化的β细胞内的转录因子。胰腺再生时，正处于增殖状态的导管上皮细胞也重新表达这一转录因子。因此IPF-1被认为是重新获得多能分化潜能的胰腺干细胞的标志[17]。国内外已有数个研究组报道成功地分离和在体外培养了表达IPF-1的人胰腺导管上皮细胞，这些细胞具有分化为胰岛细胞的潜能，因而被 认为是胰腺干细胞（pancreatic stem cell） [18-20] 。（二）胰腺干细胞的分离、培养由于胰腺干细胞主要来源于胰腺导管上皮及少量来源于胰岛，因而成功地分离胰腺导管上皮细胞就可获得大量的具有分化潜能的干细胞。但干细胞与其它细胞相比，在培养方面有其特殊性，故有必要在此予以描述。胰腺干细胞的分离：胰腺导管上皮是具有干细胞潜能的一类细胞，其在胰腺中所占比例甚少。目前成人、动物胰腺导管上皮细胞的分离多采用胶原酶消化法[18,20]。具体方法为：按供者器官切取原则和技术获取胰腺后，于导管内注入胶原酶（普通胶原酶或纯化的Liberase ），在一定温度下（30℃~37℃）消化，当观察到较多游离且完整的胰岛细胞团时，中止消化，低温清洗3次。消化后胰岛已从外分泌组织中释放出来，但仍与外分泌组织混悬在一起。由于内、外分泌组织的密度不同，可用密度梯度离心法将它们纯化。如消化的胰腺组织较多，可用Euro Ficoll或Lymphaprep 或Ficoll液在COBE 2991细胞分离机中进行连续密度梯度离心，亦可对少量组织采用非连续密度梯度离心。离心后，绝大多数胰岛即与外分泌组织（腺泡细胞和导管上皮细胞）分开而得到纯化，胰岛可用于移植等方面的研究，而外分泌组织则需进一步处理以便达到获取导管上皮细胞的目的。另一种获取导管上皮细胞的方法是将胰腺的大导管以外科方法剪取，然后再将大导管切成小块后以胶原酶消化，在显微镜下将消化后的导管上皮细胞从导管上皮和其他细胞的混悬液中挑出。此法无法获得大量的小导管上皮细胞，仅适用于需少量细胞的研究工作，此外，尚有用机械的方法将导管上皮从导管上刮下后收集，此方法难度大，收获量小，已较少有人应用。胰腺干细胞的培养：消化后的胰腺细胞经密度梯度离心后，胰岛细胞即被从混悬液中分出，而外分泌细胞中则绝大多数（＞99%）为腺泡细胞，少量为导管上皮细胞。根据这2种细胞的不同生物学特性，即导管上皮细胞在6～12小时即可贴壁生长而腺泡细胞不具备此特性，在培养的前期置换培养液时，几乎可将所有的腺泡细胞在换液时丢弃，仅留有少量的贴壁细胞即导管上皮细胞生长[20-21]。一般来说，培养早期（前3～7天）可使用未经处理的T-75培养瓶，CMRL1066培养液，37℃，5% CO2条件下培养，其中葡萄糖浓度为5.6 m