D-菌落总数测定和大肠菌群计数.ppt

菌落总数测定大肠菌群计数 连云港，2011年11月 一、菌落总数测定 GB 4789.2-2010 （一）、检验程序 （二）、操作步骤 1、样品制备 （1）、固体和半固体样品 称取25g样品至有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质容器内，均质，制成1:10的样品匀液。 （2）、液体样品 用无菌吸管吸取25mL样品至有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌容器中，混匀，制成1:10样品匀液。 2、样品稀释 用1mL无菌吸管或等效器具吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于有9mL稀释液的无菌试管中（吸管尖端不要触及稀释液液面），振荡试验，混匀，制成1:100的样品匀液。 按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，须更换无菌吸管。 3、接种 根据对样品的污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿中。 同时分别取1mL稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。 及时将15-20mL冷却至45℃的平板计数琼脂倾注平皿，并旋转平皿使其混合均匀。 4、培养 琼脂凝固后，将平板翻转，36±1℃培养48±2h 。水产品30±1摄氏度培养72±3h。 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面蔓延生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂(约4mL)，凝固后翻转平皿，按上述条件进行培养。 （三）、结果记录和表述 1、计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。 选取菌落数在30-300 CFU之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 如果有平板有较大片菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计数半平板后乘于2，代表一个平板菌落数。 平板内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），则应将每条链作为一个菌落计。 若只有一个稀释度平板上菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘于相应的稀释倍数，作为每g(mL)中菌落总数结果。 若有连个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围时，按公式计算。 若所有稀释度的平板上菌落数菌大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘于最高稀释度倍数计算。 若所有稀释度平板菌落数小于30，则按稀释度最低的平均菌落乘于稀释倍数计算。 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘于最低稀释倍数计算。 若所有稀释度的平板菌落均不在30-300，其中部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落乘于稀释倍数计算。 2、计算公式 N=Ec/(n1+0.1n2)d N=样品中菌落数 Ec=平板菌落数之和 n1=含合适范围菌落数的第一稀释度(低)平板数 n2=含合适范围菌落数的第一稀释度(高)平板数 d=第一稀释度 n1和n2为相邻的两个稀释度 如一个样品选择了1:100、1:1000和1:10000三个稀释度进行计数，菌落数分别为多不可计、多不可计； 232、244 ； 33、35，根据公式则计算如下： N=（33+35+232+244）/（2+0.1×2）×10-2 =24727=25000=2.5×104 CFU/g(mL) 3、结果表述 菌落数在100以内时，按四舍五入原则修约，采用两位有效数字报告。 大于或等于100时，前第三位数字采用四舍五入原则修约后取前2位，后面用0代替位数来表示结果，如使计算结果为357，修约后位360；也可用科学计数法表示，采用两位有效数字，如3780，表示为3.8×103。 若所有平板上位蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 若空白对照有菌落生长，则此次检测结果无效。 二、大肠菌群计数 GB 4789.3-2010 第一法 MPN计数 （一）、检验程序 （二）、操作步骤 （1）、样品稀释 固体和半固体样品：称取25 g 样品，放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。