PET系统_原核表达详细总结.ppt

PET原核表达系统 pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上。受噬菌体T7强转录及翻译信号控制，表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。 不依赖连接反应的克隆方法（LIC） 用LIC法制备的pET载体有不互补的单链粘端，与目的插入片段上相应的粘端互补。扩增目的插入片段的引物5,端序列要与LIC载体互补。T4DNA聚合酶的3 , -5 , 外切酶活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由制备好的插入片段和载体互相形成退化产物，这种方法十分快速高效且为定向克隆。pET载体上编码的氨基酸序列可通过肠激酶或X因子去掉。 Function of T7 Polymerase The 3?5 exonuclease activity of T4 DNA polymerase removes nucleotides until it encounters a residue corresponding to the single dNTPpresent in the reaction mix. At this point the 5?3 polymerase activity of the enzyme counteractsthe exonuclease activity to effectively prevent further excision. pET载体 pET载体最初是由Studier及其同事构建。 (Studier and Moffatt,1986; Rosenberg et al., 1987; Studier et al., 1990). 包括两种载体——转录载体（用于表达本身含有核糖体结合位点和起始密码子目的基因）和翻译载体（载体上带有核糖体结合位点）。一般来说，转录载体用于表达来自原核的基因，而翻译载体表达真核基因。 抗生素抗性 pET载体常用的两种筛选标记是Ampr+和Knar+ 因为内酰胺酶的消化和PH的降低，Ampr+的选择性易于丢失。某种情况下使用Knar+更为有利。 Ampr+和Knar+的另一个不同是两种基因的转录方向不同 。Ampr+位于T7启动子下游，与其方向相同。除了pET5系列，T7转录终止序列位于内酰胺酶基因前面，但是这个终止序列只有70%的有效性。因此，T7聚合酶能够通读，导致内酰胺酶的积累。相反Knar+的转录方向与T7启动子方向相反，诱导时并没有Knar+基因的增加。 用于克隆的宿主菌 用于克隆的宿主菌通常是Novablue，JM109以及DH5a。这些菌株是rec-end-型，转化效率高，且质粒产量也高，适合用于保存带有克隆目的基因的PET载体。 用于表达的宿主菌 BL21(DE3) 基因型： F– ompT hsdSB (rB– mB–) gal dcm (DE3) 无抗性 重组质粒转化到带有T7RNA聚合酶基因 的大肠杆菌中，即可开始产生蛋白了。这些菌株都是DE3溶原菌。噬菌体DE3是一种衍生噬菌体，带有噬菌体21抗性区和lacI基因，lacUV5启动子，以及T7RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出，一旦形成DE3溶原状态，就只有受IPTG诱导的lacUV5启动子指导T7RNA聚合酶基因转录。 BL21(DE3) BL21(DE3)是应用最广泛的表达宿主菌。是lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶（纯化过程可以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白BL21中更加稳定。 因为BL21(DE3)对利福平敏感，如果有必要可以用利福平来限制宿主RNA和蛋白质的背景合成。 lacUV5 Promoter T7lac Promoter T7启动子下游有个Lac启动子，它包含常规的启动子和lacI基因，T7lac与lacI启动子位置交错。采用这种载体及DE3溶原菌，lac阻遏蛋白可以作用与T7RNA聚合酶，也作用与载体T7lac启动子。阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。 pLysS和pLysE宿主菌 另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性编码表达少量T7溶菌酶（T7RNA聚合酶天然抑制物）的宿主中表达。 T7RNA溶菌酶是一种双功能蛋白，它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层，也可与聚合酶结合，阻止转录。 pLysS (or pLysE）有助于目的蛋白的抽提 The presence of pLysS (or pLysE) has the further advantage of facilitating the pre