厄贝沙坦调控JAK-STAT信号通路对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响.docVIP

精品论文 参考文献 厄贝沙坦调控JAK-STAT信号通路对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响 韦灵 王慧智 田倩 (贵州省贵阳市第二人民医院lt;金阳医院gt;心内科 550081) 【摘要】 目的 研究厄贝沙坦对大鼠缺血再灌注心肌细胞的凋亡及相关基因的影响。方法　取45只30周龄健康清洁WKY大鼠随机分为假手术组，缺血再灌注组和厄贝沙坦组。制备心肌缺血再灌注动物模型，TUNEL原位末端检测缺血再灌注区凋亡细胞，免疫组化检测心肌组织STAT1，STAT3的表达。结果　与假手术组比缺血再灌注组细胞凋亡率明显升高（plt;0.01）SP染色见STAT1蛋白表达显著增强（plt;0.01）STAT3蛋白表达显著减少（plt;0.01）与缺血再灌注组比，厄贝沙坦组细胞凋亡率明显下降（plt;0.01），STAT1蛋白表达减少（plt;0.01），STAT3蛋白表达显著增加（plt;0.01）。结论　厄贝沙坦通过对JAK-STAT信号通路的调节作用能减轻缺血再灌注心肌细胞的损伤，减少细胞凋亡，发挥心脏保护作用。 【关键词】 厄贝沙坦 缺血再灌注 JAK-STAT 细胞凋亡 尽快有效地恢复对缺血心肌的灌注是防治心肌缺血的根本措施，但是在缺血再灌注后会引起心肌超微结构功能，代谢及电生理等多方面的进一步损伤，这又是治疗心肌缺血的最大障碍。本实验从厄贝沙坦抑制AngII的两种受体AT1，AT2从而调控JAK-STAT信号传导系统的角度，探讨其抑制细胞凋亡，保护心肌的作用。 1. 材料和方法 1.1材料 45只健康30周龄清洁级Wistar京都大鼠（WKY）均由贵阳医学院实验动物中心提供，厄贝沙坦由杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司提供，TUNEL（原位末端标记）凋亡检测试剂盒有Roche公司提供，STAT1，STAT3兔抗鼠多克隆抗体由美国Santa公司提供。 1.2方法 1.2.1分组及处理 将45只WKY随机分为3组：假手术组，缺血再灌注组，厄贝沙坦组。3组均制备缺血再灌注损伤模型，其中厄贝沙坦组每天给予厄贝沙坦50mg/kg压成粉末，加入同等量蒸馏水每日灌胃一次，假手术组和缺血再灌注组均每日等量蒸馏水灌胃一次，共12周。 1.2.2心肌缺血再灌注动物模型的制备 各组大鼠均常规腹腔注射麻醉，仰卧固定，气管切开并插管，四肢皮下分别插入针型引导点极，另一端接入Modlab生物信号采集处理系统第三通道，记录标准肢体导联，沿大鼠胸骨左缘3-4肋间切开胸壁，打开胸腔，暴露心脏，于左冠状动脉前降支开口下0.4mm处穿线，并于穿线处置入一带凹槽长约4mm直径为2mm的塑料管，结扎后信号收集仪出现ST段弓背抬高，模型制备成功，结扎30分钟后剪断结扎线，取出塑料管，假手术组仅分离前降支穿线但不结扎。 1.2.3检测方法 术后立即去左室心肌组织石蜡切片（1）TUNEL细胞凋亡显色法检测心肌细胞凋亡：二甲苯脱蜡10min，换新鲜二甲苯再脱蜡10min，无水乙醇5min，90%乙醇2min，滴加20ug/ml不含Dnase的蛋白酶K，20℃-37℃作用15-30分钟，在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中洗涤3次，再用PBS配制的3%H2O2溶液室温孵育10min，以灭活切片内源的过氧化平衡溶液（BSS）洗涤3次，在样品中加入50ul生物素标记液，37℃孵育60min，用PBS洗涤1次，放入标记反应终止液中室温孵育10min，用PBS洗涤3次，在样品中加入50ul酶联亲和素（Streplaridin-HRP）工作液室温孵育30min，用PBS洗涤3次，加0.2-0.5ml二氢基联苯胺(DAB)显色液，室温孵育5-30min，PBS洗涤3次，用苏木素染色液进行细胞核染色，PBS洗涤3次，直接观察。以DNA酶处理切片做阳性对照，标记液代替TUNEL反应液做阴性对照，每张切片随机选取10个视野计数凋亡阳性细胞，计算凋亡指数（AI）：AI=视野内凋亡细胞数/视野内所有细胞数times;100%。（2）免疫组化检测STAT1，STAT3的蛋白表达：取3mmtimes;3mmtimes;5mm大小的左室心肌组织，以10%甲醛固定，石蜡包埋切片，3%H2O2溶液封闭，PBS冲洗，置于0.01%枸橼酸盐缓冲液中，微波抗原修复，滴加非免疫血清封闭液，室温孵育，弃血清，一抗分别滴加STAT1，STAT3抗体，常规脱水，透明，封片后光镜下观察STAT1，STAT3蛋白表达指数：未见明显核转移现象，每张切片随机选取阳性细胞分布均匀的10个视野计数无核转移细胞占整个视野细胞总数的百分比，取平均值。 1.3统计学处理