米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆表达及水解特性.pdf

华 南 理 工 大 学 学 报 (自然 科 学 版) 第40卷 第8期 JoumalofSouthChinaUniversityofTechnology (NaturalScienceEdition) Vo1．40 No．8 2012年 8月 August 2012 文章编号：1000-565X(2012)08—0088—07 米曲霉碱性蛋白酶基因的克隆表达及水解特性术 柯野 陈丹 李家洲 谢明权 罗晓春 (1．华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州 510006；2．广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东 广州 510300) 摘 要：米曲霉碱性蛋白酶对植物蛋白具有高效的水解能力和较好的脱苦作用．为了便 于大量获得该酶以利于工业上的应用，文中通过 RT．PCR克隆获得米 曲霉碱性蛋 白酶基 因，将之转化到毕赤酵母KM71菌株中并成功表达，之后用该酶进行牛胰岛素氧化链 B 链及大豆和花生蛋 白的水解试验．结果显示：在 10L发酵罐中诱导表达时，发酵液中重组 碱性蛋白酶的酶活达4100U／mL；该蛋 白酶最适反应pH值和温度分别为8．5～9．5和50℃， 在pH值为6．0～10．0和温度低于40qC时具有较好的稳定性；该酶具有广泛的肽键选择 性；该酶对大豆和花生蛋 白显示出了强于部分商品化蛋 白酶的水解能力．以上结果表 明： 该重组蛋白酶具有较大的开发利用潜力． 关键词：米曲霉；重组碱性蛋 白酶；毕赤酵母；克隆；表达；水解特性 中图分类号：Q814．9；TS201．2 doi：10．3969／j．issn．1000—565X．2012．08．015 蛋白酶是一类重要的工业用酶，占整个工业用 提高碱性蛋 白酶产量，且发酵过程易受多种 因素 酶量的60％以上；其中，碱性蛋 白酶约 占蛋 白酶总 (如易污染或菌株生长状态)影响．另外，米 曲霉产 量的一半，广泛应用于食品加工、皮革、医药和化工 生的蛋 白酶种类较多，这增加 了碱性蛋 白酶的纯化 等行业…．目前商业化的碱性蛋白酶主要来源于芽 难度，阻碍了其进一步的开发利用 ．有关该酶的 孢杆菌，来源于真菌的极少 ．米 曲霉 (Aspergillus 酶学性质、异源表达和水解特性等的研究 目前鲜见 oryzae)是一种能产生多种蛋白酶的真菌 ，据 2007年 报道． 对该菌的全基因组序列报道，通过对该基因组的分 毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是 目前表达 析预测，发现该菌共有134个蛋白酶基因，其中69个 异源蛋白性能较好的系统之一，其操作工艺简单，表 为外肽酶、65个为内肽酶，但只有少数蛋 白酶的功 达量高．该系统能对表达的蛋 白进行折叠和翻译后 能与性质被解释清楚 J．该菌广泛应用于豆酱、酱 修饰，获得具有活性的 目的蛋白，此 目的蛋 白能直接 油和酒类酿造等发酵工业．在酿造工业 中，米 曲霉产 分泌至发酵液 中便于分离与纯化．目前 已有较多外 生的酸性蛋 白酶活力较低(主要以产生碱性蛋 白酶 源基因在该系统中成功表达 的报道 ．文中主要通 和中性蛋 白酶为主)，尤其是碱性蛋 白酶对底物蛋 过克隆获得米 曲霉碱性蛋 白酶基因，以期能在毕赤 白的水解程度对水解物产生的独特风味和脱苦味起 酵母表达系统中进行异源表达，提高其产量，并对其 着关键作用 ¨I4J．目前，国内外学者对米 曲霉的研 酶学性质和水解性质进行初步研究，为该重组碱性 究主要集中于通过优化固体 (