嗜水气单胞菌AH1+quorum+sensing负调控Ⅲ型分泌系统的表达.pdf

中国科协第四届优秀博士生学术年会论文集 嗜水气单胞菌AH-1 quorumsensing负调控Ⅲ型 分泌系统的表达 鼠良产 中山大学生科院，广州。510275 摘要本研究通过构建嗜水气单胞菌AH-1Quorum Sensing两个关键调节基因ahyI。ahyR的 突变菌株来系统分析嗜水气单胞菌AH．1TTSS基因，在ahyI突变茵中，TTSS分泌效应因子 由信号分子控制，进一步验证了Quorumsensing负调控TTSS基因，总之，本研究第一次在 嗜水气单胞菌AH．1发现QuorumSensing负调控TTss基因的表达，相关研究在国内外未见 报道． 关键词微生物学；嗜水气单胞茵；quorumsensing；系统；负调控 嗜水气单胞菌(Aeromonas 括肉类，鱼以及蔬菜)和多种动物包括健康人的肠道中；近年来，该菌引起感染性腹泻的报告在全世界日益 增多，已受到国内外学者的广泛关注【l’2】。这种细菌对水中的氯和各种抗生素的抵抗性越来越强，因此环境 保护机构已经把它放在污染物候选名单上并且从2002年开始监控美国自来水供应中嗜水气单胞的含量【3】。 IIIsecretion Ⅲ型分泌系统(Type 将其产生的致病性蛋白通过Ⅲ型分泌系统送入宿主细胞质而发挥毒性作用【4’5一】。Quorumsensing系统(简 称QS系统)是指细菌根据特定信号分子的浓度可以检测周围环境中自身或其他细菌的数量变化，当信号分 子达到一定的浓度阈值时，能启动菌体中相关基因的表达来适应环境中的变化【7】。在嗜水气单胞菌AH-1中， 抑制Ⅲ型分泌系统向胞外分泌毒性蛋白因子，相关研究在国内外未见报道。 l材料与方法 1．1菌株，质粒和培养条件 soy soy 本研究所用的菌株及质粒见表1，嗜水气单胞菌AH—l于TSB(trypticbroth)或者TSA(tryptic ll la chloramphenicol(30 g／m1)。大肠杆菌与嗜水气单胞菌AH·l之间的质粒结合转移的条 g／m1)，Tetracycline(5 件为30℃，平板matin936dx时。 1．2分子克隆技术及Southern杂交 移DNA到尼龙膜、杂交条件和显色反应均参考说明书。 13基因组步移(genomewalking)和PCR分析 2用于基因组步移和PCR分析，用以下5种限制性内切酶来构建 Clontech公司的Advantagepolymerase 98 72℃4升钟，以及32个循环的94C15秒和67℃3分钟。扩增片段克隆进口GEM-Teasy 井转化到太肠杆菌JMl09中然后测序。 14构建插^和缺失突变株以及重组质粒 嗜水气单胞菌AH—I ahyI插入突变株和ahyR缺失突变株的构建如下： 引物AHYR-3 CTCTTGCAG扩增ahyR上游序列为315bp． CGCGGTACCGTCAGCTCCCACACGTCGTfA时1-2 变通过与嗜木气单胞茁AH．I结合转移并进行单交换获得，最后用FCR方法验汪。 和B∞融酶切的质粒pRWS0上，冉通过结合转移的方法转化到嗜水气单臌菌AH-I野生型及突变堑茼株中。 1,5 B-G丑1日ctodda∞植测 1．6二维电泳(2·DE) 后用Bic-Rad公司的pDQr．．EST softwarepachage扫描和分析。 1．7 DNA测序殛序列分析 DNA测序采用应用生物系统PRISM B·∞y啦心)。序列分析采用VectorNTI7．0DNA分析软