植物生理学研究技术实验指导.doc

实验一、叶片培养---植物组织培养中的脱分化与再分化过程 在组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转化为分生状态的过程，也就是愈伤组织形成的过程， 称为脱分化(dedifferentiation)。植物的成熟细胞经历了脱分化之后，形成愈伤组织，由愈伤组织能再形成完整的植株，这一过程称为再分化(redifferentiation)。影响细胞分化和器官建成的内外因素(光照、温度、湿度、营养、激素等)很多，植物激素是最关键的因素，其中生长素和细胞分裂素的比例起决定作用。Skoog和Miller(1957)IAA/CTK比值高时促进生根，低时促进茎、芽的分化，两者浓度相等时，组织倾向于以一种无结构的方式生长。对多数物种，激素调控器官发生都适用，但由于各种植物或不同的器官（及组织）中的内源激素的含量和动态变化不同，因此对于某一种具体的形态发生过程而言，它们所要求的外源激素水平也会有所不同。 实验目的：通过此实验使学生初步掌握植物组织培养的基本方法，并了解植物细胞的脱分化和再分化过程以及植物激素的调控作用。 实验原理：根据“植物细胞全能性”的理论，植物细胞具有全套遗传信息，在适当条件下，可以通过脱分化和再分化途径进行器官发生，并进一步发育成完整再生小植株。在细胞分化和器官发生过程中，植物激素起着重要的调控作用，在植物激素不同的浓度配比下诱导外植体向不同的方向分化。 实验材料：烟草叶片。 仪器设备：高压灭菌锅，超净工作台，光照生长箱，pH汁、电炉，烧杯，搅棒，容量瓶，试剂瓶，量筒，移液管，白搪瓷杯，三角瓶，培养皿，酒精灯，手术刀，镊子，手术剪等。 试剂:酒精,氢氧化钠,6-苄基嘌呤(BA),萘乙酸（NAA）和MS培养基中无机盐和有机物。 实验步骤: 1.配制培养基 按MS培养基配方(见附录)，配制各母液。 (1)按下表，配制lO倍大量元素母液。 lO倍大量元素母液: 大量元素 NH4NO3 KNO3 CaCl2 ·2H2O MgSO4· 7H2O KH2PO4 重量(g) 16.5 19.0 4.4 3.7 1.7 用蒸馏水溶解定容至1000毫升(CaCl2 2H2O需单独溶解，稀释后再与其它大量元素溶液混合) （2）按下表，配制100倍的微量元素母液。 100倍的微量元素母液: 微量元素 KI H3BO3 MnSO4·4H2O ZnSO4· 7H2O NaMoO4· 2H2O CuSO4· 5H2O CoCl2· 6H2O 重量（mg）83 620 2230 860 25 2.5 2.5 用蒸馏水溶解，定容至1000 ml (MnSO4·4H2O 需先用少量1NHCl溶解，然后再与其它微量元素溶液混溶)。 （3）200倍铁盐母液的配制: 称取Na2EDTA： 3.37g；FeSO4·7H2O：2.78g500ml(溶解时可加热)。 （4）有机附加物的配制： 20mg/ml 的肌醇溶液:：称取2g肌醇，用蒸馏水定容至100ml。 0.5mg/ml的烟酸溶液：称取50mg烟酸，用蒸馏水溶解后定容至100ml。 1.0mg/ml的甘氨酸溶液：100mg的甘氨酸，用蒸馏水溶解后定容至100ml。。 0.5mg/ml 的盐酸吡哆醇（VB6）溶液:50mg盐酸吡哆素，用蒸馏水定容至100ml。 0.1mg/ml盐酸硫胺素（VB1）溶液:10mg盐酸硫胺素，用蒸馏水定容至100ml。 （5）植物激素的配制： 10－3mol/L的萘乙酸（NAA）溶液：称取18.6mg 萘乙酸，用少量95％乙醇溶解后，用蒸馏水稀释并定容至100ml。 10－3mol/L的6-苄基嘌呤 (BA) 溶液: 称取22.5mg BA，用少量lmol/L的HCl溶解后，用蒸馏水稀释并定容至100ml。 2 将各种元素母液混合,配制MS培养基,其中1L体积中含 大量元素母液 100ml 微量元素母液 10ml 铁盐母液 5ml 肌醇母液 5ml 甘氨酸母液 2ml 烟酸母液 1ml 盐酸硫胺素（VB1）母液 1ml 盐酸吡哆醇（VB6）母液 1ml 蔗糖 30g 琼脂 7g 再按下列浓度分别加入萘乙酸和6-苄基嘌呤母液： 培养基 1 2 3 NAA 1×10－6 mol/L 1×10－6mol/L 5×10－7mol/L BA 1×10－6mol/L 1×10－7mol/L 1×10－6mol/L (注意: 1号培养基需加入10－3mol/LNAA母液lml，10－3mol/LBA母液lml; 2号培养基需加入10－3mol/LNAA母液lml，10－3mol/LBA母液0.1ml; 3号培养基需加入10－3mol/LNAA母液0.5ml，10-3mol/LBA母液1ml) 3 煮沸培养基并分装 将培养基定容到1000ml后，用l mol