蛋白质分离纯化实验报告模板蛋白质分离纯化实验报告模板.doc

高级生物与分子生物学 实验报告 姓名： 学号： 指导老师： 实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达 【实验原理】： DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4 DNA连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒。 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因（本实验质粒带有卡那霉素抗性基因），根据转化菌的耐药特性进行删选。 裂解法小量制备质粒DNA的原理：SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存在于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的蛋白质。 重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切，酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒DNA。 组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导。IPTP的终浓度为1mmol/L。 融合蛋白的表达检测的原理：经诱导表达的重组体裂解后，经SDS鉴定。染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无此蛋白带。 【实验步骤】： 1.配制LB和LK培养基 2.连接：质粒片断＋目的基因 （1.5ml离心管），16℃水浴过夜，65℃水浴10min，灭火连接酶。 ddH2O 12ul X-DNA(目的基因） 3ul pET-28a（质粒片断） 2ul 10×buffer 2ul T4 ligase 1ul 3.复苏DH5a和BL21，并接种DH5a 1支，接种BL21 1支（10ul菌液+2ml LB）于试管，第二天7：30分别转接DH5a和BL21 （1ml+20mlLB）于烧瓶。（分别准备制备感受态，两个连接反应用来转化） 4.DH5a和BL21感受态细胞的制备： 在烧瓶孵育2.5h后，取1.5ml菌液至1.5ml离心管，4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/l CaCl2 ，混匀，离心4000rmp，5min，弃上清，加500ul 100mmol/l CaCl2 ，混匀，冰浴30min，离心（4℃，4000rmp，5min），弃上清。加100ul 100mmol/l CaCl2 ,重新悬浮沉淀。 5.转化：另取1.5ml离心管，加连接反应液20ul，再加50ul DH5a和BL21感受态细菌，混匀，冰浴30min。42℃水浴90s，再冰浴1-2min。加500ulLB，37℃摇床培养1h。5000rpm, 离心3分钟 倒上清，重悬沉淀。 6.涂板，37度过夜培养（DH5α：感受态一块LB,感受态一块LK 转化菌一块LK, BL21同样） 7.检查细菌生长情况，只有转化菌才能在含卡那霉素的培养基生长 8．质粒提取-碱裂解法 9.质粒酶切反应：在1.5ml离心管中加入以下物质，充分混匀后，瞬时离心，37度保温1-2小时 ? 单酶切(ul) 双酶切(ul) ddH2O 14 13 10(buffer 2ul 2 质粒 3ul 3 BamH I 1 1 Xho I / 1 Total 20 20 10.琼脂糖凝胶电泳：溶胶（用TAE缓冲液，充分融化），稍冷却后倒胶，加样（样品要加样品缓冲液至1(），电泳（1-10V/CM)，染色与观察拍照。 11.蛋白诱导表达：（BL21） 12.SDS过程 ①配胶 ②样品制备 ③加样 ④电泳（200V） ⑤染色：考马斯亮蓝染色或银染 【实验结果】： 重组质粒的鉴定 　空　双 单 质 Ｍ 双 单 质 融合蛋白的表达检测 0h 1h 3h 0h 1h 3h 【实验分析】： ⑴ 在重组质粒酶切鉴定图谱中，第一加样泳道为DNA marker, 接下来的三泳道依次为：没有经过酶切的重组质粒加样泳道，双酶切的重组质粒加样泳道，单酶切的重组质粒加样泳道。经过分析，经单酶切的重组质粒两片段的分子量大小分别符合载体pET28a（+）和目的基因X的大小，即重组质粒构建基本成功。但是，每一泳道都有拖尾，这可能是酶切时间过短，使酶切不彻底，也可能是限制性内切酶活性不高，未放于冰上，使其酶切效果不佳。也有可能是胶制作不