绘制双倒数曲线.ppt

生物化学实验 碱性磷酸酶Km值的测定 一、实验内容 二、实验报告要求 实验目的 1、掌握底物浓度对酶促反应速度的影响 2、掌握米曼氏方程、Km值的意义及双倒数作图求Km的方法。 一、实验内容 （一）实验原理 （二）实验操作 （一）实验原理 （磷酸苯二钠法 ） 底物浓度对反应速度的影响：呈矩形双曲线 双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法 （二）实验操作 【注意事项】 1、底物、血清取量务必准确。 2、 保温时间务必准确。 3、绘制双倒数曲线时，一定要过原点 （二）721分光光度计的使用 （三）常规仪器的使用 2、数据结果计算 3、作图要求： 二、实验报告要求 （一）实验名称 （二）实验原理 （三）实验操作表、OD值纪录 （四）结果处理：作图 1、绘制矩形双曲线坐标图 2、绘制双倒数曲线坐标图、并求出Km值 * * 磷酸氢二钠 根据红色深浅就可测出醌衍生物的含量，从而反映酶浓度一定时，底物浓度对酶的饱和效应 。 [S] V Vmax 当反应速度为最大反应速度一半时 Km值的推导： Km＝[S] ∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 Vmax[S] Km+[S] V = （林－贝氏方程） + 1/V= Km Vmax 1/Vmax 1/[S] 两边同取倒数 1．取8支大试管，编号，按下表依次加入： 管号 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 8 0.04mol／L底物液 0.15 0.20 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0.00 0.1mol／L碳酸缓冲液(pH10) 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 蒸馏水 0.85 0.80 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.00 混匀后，37℃水浴，预热5min左右。 酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 每管加入酶液后立即混匀（保持在37℃水浴中），反应开始，从加入酶液起计时至下一步加入碱性溶液停止反应，各管反应时间准确一致，为15min。 0.5mol／L NaOH（碱液） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4-氨基安替比林 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 铁氰化钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混匀，室温放置10min左右，以8号管空白调零，于510nm比色，记录各管的吸光度。 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 A510值 ? ? ? ? ? ? ? 空白调零 底物浓度(mmol／L) 3 4 5 6 8 12 16 0 1／[S] 0.333 0.250 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 - 1／v （1／A510） ? ? ? ? ? ? ? - 等距离底物浓度标识 横轴 各管吸光度连线 曲线 曲线形状 观察 等距离吸光度标识 纵轴（V） （1）绘制矩形双曲线： OD [S] 等距离吸光度的倒数（1／A510）标识 纵轴（1/V） 各管吸光度的倒数标识 曲线 ①直线形状 ；②计算Km值 观察 等距离底物浓度的倒数（1／[s] ） 横轴 （2）绘制双倒数曲线：