胶内酶解.doc

一、???? 试剂准备 1．30mmol/L K3Fe(CN)6? 铁氰化钾 9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水 ? 2．100mmol/L Na2S2O3? 硫代硫酸钠 ?? 24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水 ? 3．200mmol/L NH4HCO3 碳酸氢铵 ?? 0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水 ? 4. 覆盖液 （酶解缓冲液） ?? 40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN ?? 200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水 ? 5. 萃取液 ?? 50％ ACN，0.1% TFA ? 6. 胰蛋白酶 贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。 ?? 工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL ? 7. 脱色液 ?? 银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合 ?? 考染脱色液：50％ ACN, 40mmol/L NH4HCO3 ??????? 以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。 ? 二、???? 实验步骤 1.????? 切胶 用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。 ? 2.????? 脱色 银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。 （3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O） 考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。 3.????? 洗涤 向每管加入200uL 40mmol/L NH4HCO3，振荡洗涤2min，多余液体吸出丢弃，重复1次。 ? ???? 4. 脱水 向每管中加入100-150 uL 纯ACN，振荡脱水，待胶粒变白后，将CAN吸出舍弃，将装有胶粒的离心管开盖置于真空干燥箱或真空浓缩仪中干燥处理10min。 ? ???? 5. 酶解 ??????? a) 根据胶粒大小，加入合适体积的胰蛋白酶工作液（浓度10ng/uL），以完全盖住胶粒为准，冰浴45min，使胶粒充分吸收酶解液并溶涨。 b) 将管内多余的酶解液吸出舍弃，加入20-40uL覆盖液（以完全盖住胶粒为准），倒置放在37度烘箱中孵育过夜（12-16小时）。 ? ???? 6. 肽段抽提 ??????? 次日，吸出管内酶解溶液，置于另一0.5 ML EP管中，在装胶粒的原EP管中加入萃取液20uL, 振荡洗涤20min，吸取液体与第一次吸取的液体合并，再次加入萃取液20uL, 振荡洗涤10min，并超声5min，吸取液体与前两次合并。 ? ???? 7. 离心 ??????? 将新管内三次萃取的液体于离心机内10000rpm离心5min，吸取上层溶液转移至新的EP管内，注意不要吸取底部可能存在的微小胶粒沉淀。 ? ???? 8. 真空干燥 ??????? 将装有抽提液的离心管开口置于真空干燥机内浓缩抽干，约需3h左右，再加入0.1%的TFA水溶液复溶，置于－20度冻存待用于质谱鉴定。 三、???? 注意事项 1.? ?操作过程中必须带手套、口罩 2.? ?使用干净新鲜的溶液，不能有杂质和混浊物 3.? ?酶解在干净无尘环境下操作 4.? ?注意离心管，枪头干净，全部使用进口产品 5.? ?每次实验设置一个空白对照（从胶上无点位置去一块胶粒同时实验）和?污染控制对照（使用无样品的空离心管，操作同于样品处理） 如何看明白和分析质谱测试报告？这是一个每次都被问到的问题，所以在这里贴上测试报告的截图和截图说明，希望对大家有所帮助。 一、报告标题（Analysis Information） 1 Report Type:说明样品是Gel based模式（2D胶）或LC based（LC-MS），可不用深究。 2 Analysis Type:说明分析类型，有三种：MS(仅分析一级肽指纹质量)；MS/MS（仅分析所有二级肽碎片质量）；Combined MS+MS/MS（一级肽指纹质量与二级肽碎