酶工程实验20100506更新.doc

实验一 过氧化氢酶米氏常数的测定 目的 了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。 实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。 本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km 实验器材 锥形瓶100～150ml（×6）。 吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。 温度计（0～100℃）。 微量滴定管5ml（×1）。 容量瓶1000ml（×1）。 实验试剂 1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0） 取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。 2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。 3、0.02mol/L KMnO4 ：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。 4、0.004mol/L KMnO4 ：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。 5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）。 6、25% H2SO4 五、操作 取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂： 表一 过氧化氢酶米氏常数的测定 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 0.05mol/L H2O2/ml 蒸馏水/ml 酶液/ml 0 9.5 0.5 1.00 8.50 0.5 1.25 8.25 0.5 1.67 7.83 0.5 2.5 7.0 0.5 5.00 4.50 0.5 先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。各瓶时间达5min时立即加2.0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀。用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。 六、计算 分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。 [S]=c1V1/10 式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）； c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）； V1：H2O2体积（ml）； 10：反应的总体积（ml）； υ：反应速度（m mol/min）； c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）； V2：KMnO4体积（ml）； 以1/υ对1/[S]作图求出Km。 实验二 酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定 目的： 了解酶的纯化方法。 原理： 酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。（请参考相关教材） 试剂与仪器 1、试剂与材料： 干酵母 石英砂 1 mol/L醋酸溶液 2 mol/L氢氧化钠溶液 醋酸缓冲液（pH 4.6） 5% 蔗糖溶液 DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂 2、仪器： 电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。 操作方法 破碎细胞 取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min，放入冰箱冷冻室（-20℃）冰冻约20 min（研磨液面上刚出现冰结为宜）。 取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min，小心取出上清液（组分一）并量出体积V1，分别取0.5 ml上清液到试管A、B中，余者倒入三角瓶。 纯化 把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液调pH 5.0（试纸）。然后迅速放入到55 ℃的水浴中，保温30 min。之后在冰浴中迅速冷却。在5000 r/min条件下离心12 min。取出上清液（组分二）并量出体积V2，分别取0.5 ml上清液到试管C、D中。 酶反应 取四支试管，分别按顺序加入反应物： 试管编号 ①酶液 ②氢氧化钠溶液 ③醋酸缓冲液 ④蔗糖溶液 A（对照管） 0.5 ml 1 ml 1 ml 1 ml B 0.5 ml --- 2 ml 1 ml C（对照管） 0.5 ml 1 ml 1 ml 1 ml D 0.5 ml --- 2 ml 1 ml 试管中反应物在55 ℃水浴中反应5