体外受精操作流程 复杂.docx

哺乳动物体外受精的基本操作程序，主要环节包括以下几个方面:(一)卵母细胞的采集和成熟培养1．卵母细胞的采集：卵母细胞的采集方法通常有三种。(1)超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。在大家畜中，由于操作程序复杂，成本较高，很少使用。这种方法的关键是掌握卵子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精能力的时间，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前冲取。 (2)从活体卵巢中采集卵母细胞 ：这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。在家畜中， 牛和马等大家畜常用超声波探测仪辅助取卵，其方法是用手从直肠把握卵巢，经阴道壁穿刺插入吸卵针，借助B型超声波图像引导，吸取大卵泡中的卵母细胞。按照目前的技术水平，一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。在家畜中，活体采集的卵母细胞一般要经成熟培养后才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母畜具有重大意义，在有些国家已用于商业化生产。 (3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞：这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30℃~37℃)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。用此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期(GV期)，需要在体外培养成熟后才能与精子受精。从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的保温和防止细菌污染。因此卵巢从畜体摘取后须放入含有生理盐水或磷酸缓冲液（PBS）的保温瓶中；吸卵前卵巢要用生理盐水或PBS多次洗涤；所用溶液都要添加抗生素。这种方法的最大优点是材料来源丰富，成本低廉，但确定母畜的系谱困难。2．母细胞的选择：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocytecomplesx COC）。无论采用何种方法，采集的COC都要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中，常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。在体外受精实践中，一般只培养A级和B级卵母细胞。 3．卵母细胞的成熟培养：由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。培养时，先将采集的卵母细胞在实体显微镜经过挑选和洗涤后，然后放入成熟培养液中培养。家畜卵母细胞的成熟培养液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培养法，微滴体积为50-200微升，每滴中放入的卵母细胞数按每5微升一个计算单位。卵母细胞移入小滴后，放入二氧化碳培养箱中培养，培养条件为39℃、100%湿度和5%二氧化碳的空气。牛的培养时间为20-24小时，卵丘卵母细胞复合体经成熟培养后，卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。(二)体外受精1．精子的获能处理：哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。2．受精：即获能精子与成熟卵子的共培养，除钙离子载体诱导获能外，精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。受精培养时间与获能方法有关。在B2液中一般为6-8小时而用TALP或S.F液作受精液时可培养18~24h。精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密度为1~9×10 6/ml，每10微升精液中放人1~2枚卵子，小滴体积一般为50~200微升。(三)胚胎培养精子和卵子受精后，受精卵需移入发育培养液中继续培养以检查受精状况和受精卵的发育潜力，质量较好的胚胎可移入受体母畜的生殖道内继续发育成熟或进行冷冻保存。提高受精卵发育率的关键因素是选择理想的培养体系。在家畜中，胚胎培养液分为复杂的和化学成分明确的培养液两大类。复杂培养液中的成分很多，除无机和有机盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。用它们培养胚胎时，可以采用体细胞共培养体系，即体细胞与胚胎在微滴中共同培养，利用体细胞生长过程中分泌的有益因子，促进胚胎发育，克服发育阻断。受精卵的培养广泛采用微滴法，胚胎与培养液的比例为一枚胚胎用3~10微升培养液；一般5~10枚胚胎放在一个小滴中培养以利用胚胎在生长过程中分泌的活性因子，相互促进发育。胚胎培养条件与卵母细胞成熟培养条件相同。有的实验室采用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合气体培养，以降低培