乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临.doc

乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临床疾病状态的关系 ? 范振平　王福生　徐东平　褚福亮　施明　周宇　张玲霞 作者单位：100039 北京，解放军第三二医院生物治疗研究中心（范振平、王福生、徐东平、褚福亮、施明、周宇），专家组（张玲霞） 通讯作者：王福生，Email: fswang@public.bta.net.cn ? 【摘要】　目的　通过定量分析HLA-A*2402限制性的乙型肝炎病毒(HBV)特异性的细胞毒性T细胞(CTL)来研究急性自限性和慢性持续性乙型肝炎患者体内免疫反应的差异。方法 从急性和慢性乙型肝炎感染患者外周血中提取外周血单个核淋巴细胞（PBMC），用HLA-A*2402-HBV肽链四聚体复合体染色后，用流式细胞仪检测HBV特异性CTL细胞。同时使用酶联免疫斑点法来检测部分患者的CTL细胞分泌干扰素(IFN)-γ的水平。 结果 在7例急性乙型肝炎的急性期，可以检测到高水平的HBV特异性的CTL细胞，而在急性乙型肝炎的恢复期，HBcAg特异性CTL细胞的水平可以明显下降。在13例慢性乙型肝炎患者中，除了1例慢性肝炎急性暴发患者之外，均不能检测到HBcAg特异性CTL细胞。IFN-γ的分泌与这些结果相一致。结论　HBcAg特异性CTL细胞在急性肝炎患者清除乙型肝炎病毒的过程中可能起到至关重要的作用。 【关键词】　T淋巴细胞，细胞毒性；HLA抗原；肝炎，乙型；pMHC-四聚体 ? 急性乙型肝炎患者体内存在多特异性的和多克隆特异性的细胞毒性T细胞（CTL），而慢性乙型肝炎患者体内的特异性的CTL却恰恰相反［1］。在慢性乙型肝炎病情急性加重时可以检测到CTL细胞数量相应增加［2］。由此可见，针对乙型肝炎病毒(HBV)抗原特异性的CTL在清除病毒和引起肝脏病理损害的过程中起着重要作用［3,4］。就HBV而言，人类白细胞抗原(HLA)限制性多肽（或称之为抗原表位）存在于HBV蛋白质抗原的多肽链中，目前在HBV特异性CTL识别的21个HBV表位中，有16个是HLA-A2限制性的［1-5］。目前见到有关针对HBV特异性CTL的临床免疫学研究的报道较少。此外HLA-A*2402是我国人口中常见的HLA-Ⅰ型等位基因之一［6，7］。我们使用HLA-A*2402-HBV肽链-四聚体复合体在国内首次分析HBV感染的患者外周血中核心抗原特异性的CTL细胞并分析了它的临床意义。 ? 对象与方法 一、对象 HLA-A24阳性的急性乙型肝炎患者7例，其中男4例、女3例，平均年龄24.4岁±3.9岁，丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平（1031 U/L±157 U/L）；慢性乙型肝炎患者13例，其中男11例、女2例，平均年龄29.7岁±2.5岁，ALT水平为（129 U/L±122 U/L），均来自解放军第三○二医院门诊和住院患者。对照组选择年龄和性别相仿的HLA-A24阴性的6例急性乙型肝炎患者以及17例慢性乙型肝炎患者。所有患者的诊断标准均符合2000年第六届传染病和寄生虫病会议（西安）制定的肝炎诊断标准［8］。急性乙型肝炎的诊断基于ALT升高（至少高于正常上限10倍），既往没有乙型肝炎病史，血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性，同时血清中抗HBcIgM阳性,急性肝炎患者发病6个月内转氨酶恢复正常，从血清中清除HBsAg和HBeAg。慢性乙肝患者的诊断依据是：HBsAg阳性超过6个月，且伴有ALT轻中度升高。所有患者均为HCV、HDV和HIV病毒抗体阴性。 二、方法 1. 病毒学测定：HBsAg，抗HBs, HBeAg , 抗HBe, 抗HBc, 抗HBcIgM, 抗HDV，抗HCV，抗HIV的检测试剂购自深圳达安公司，血清中HBV DNA水平检测使用深圳市匹基生物工程有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒，具体步骤按照说明书操作进行。 2. HLA-A24分型：用顺序特异引物聚合酶链反应技术（PCR-SSP）［9］对所需病例进行筛选，所用引物由赛百盛公司合成。 3. 藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的HLA-I四聚体复合体的合成：PE标记的HLAA*2402-HBV肽链四聚体复合体(HBV肽链选自HBV核心抗原第117～125氨基酸,序列为EYLVSFGVW,以下简写为HBV-C117-125)和PE标记的小鼠的IgG1抗体做为阴性对照，均购自英国ProImmune公司。抗-CD8-异硫氰酸荧光素（FITC）单抗购自美国BD公司。同时为排除HLA-A*2402-HBV肽链四聚体的非特异性连接，我们使用HLA-A24阴性的肝炎患者作为阴性对照，估计在所有CTL细胞中,非特异性检出率平均0.04%（平均值±3标准差）［10］。 4. pMHC-四聚体流式细胞分析：（2～3）×105个新鲜分离的