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凝胶过滤色谱填料 第三组 目录 概述 凝胶过滤色谱是体积排除色谱（SEC）的一种。 溶质只依据其分子体积（流体力学体积） 的大小而分离。 与其他色谱相比较的优点： 凝胶过滤色谱的分离原理 ◆凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料的色谱柱中进。 ◆当流动相携带分子量不同的溶质进入色谱柱后。 ①因浓度差而可能渗入或扩散进入填料的孔中，即溶质在两相中的运动是由浓度梯度推动的。 ②分子体积的大小，造成了在孔中扩散途径的差异，溶质分子只能进入尺寸比它大的孔； 凝胶过滤色谱填料的种类和性能 用于凝胶色谱的填料主要是 用天然的多糖类原料制成的，它们的机械强度低，粒径较大而不均匀，很难在高流速下流动，费时、费力且分辨率也很低。 以可控孔径玻璃（CPG）、硅胶为基质的无机基质高效凝胶色谱填料和以合成高分子或高交联天然高分子为基质的有机高效凝胶色谱填料相继问世，他们均基本上可以满足上述要求。 ！ ！ ！ 指的是可用于分离的样品的最大分子量。 一般以具有不同分子量的葡聚糖，聚乙二醇为样品绘制工作曲线后确定。需要注意的一点是，因为在溶液中蛋白质常呈球形，而PEG和葡聚糖则是线性分子，依据此工作曲线会带来很大的误差。故最好以蛋白质标准样品来标定凝胶过滤色谱的工作曲线。 由工作曲线可确定该凝胶过滤色谱柱的分离范围，指的是工作曲线线性部分所对应的分子量区间。 凝胶色谱填料的制备 未经化学键合或改性的多空硅胶或可控孔径玻璃，可以直接用于中性糖的寡聚物和聚合物的分离，近年来，经葡聚糖键合至硅胶上或包敷在硅胶上制成的填料亦有报道和销售。但用于生物高分子，如蛋白质、核酸等分离时，还是以进行表面亲和处理为宜。即将其表面加以修饰，令其带上亲水性基团。 制备方法如下：见书246 即以环氧丙基三甲氧基硅烷为硅烷化试剂，以高孔隙度硅胶为基质，键合反应后，再令其环氧基开环，生成二醇型化学键合硅胶。 常见凝胶过滤色谱填料 表11-8列出了常见的无机型亲水凝胶，尽管牌号各异，但其化学本质几乎均是二醇型化学键合硅胶。 ！见书本247页 凝胶过滤色谱的应用 例1.凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性 利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解液，水解液经Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分子量分级，根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。 在最佳条件下绘制标准曲线，并根据标准曲线判断分离组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定法（FRAP）、二苯基苦基苯肼法（DPPH）以及金属铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化能力，并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC分离和氨基酸组成分析 凝胶过滤色谱的应用 例2.蛇毒纤溶酶Fibrolase 的凝胶过 滤色谱复性 方法: 使用透析和凝胶色谱对Fibrolase 复性进行研究, 比较2 种复性方法的相对复性率及蛋白质回收率。结果: 2 种复性方法的复性率分别为20%、25%, 蛋白质回收率分别为16%、5%。 结论:凝胶过滤色谱复性优于透析法复性, 凝胶过滤色谱复性使蛋白质的复性与纯化同步进行, 简化了操作程序, 提高了产品回收率。 凝胶过滤色谱的应用 例3.葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定两种氨基酸锌螯合物螯合率的差异性 采用葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定蛋氨酸锌、苏氨酸锌两种氨基酸锌螯合物的螯合率，发现该法测定结果与其他测定方法分析结果一致，表明此法适用于测定蛋氨酸锌的螯合率 但测定苏氨酸锌螯合物的螯合率时，测定结果与其他测定方法分析结果不一致，结合葡聚糖凝胶过滤色谱柱法测定过程，表明此法不适用于测定苏氨酸锌的螯合率。 * 概 述 凝 胶 过 滤 色 谱 分 离 原 理 凝 胶 过 滤 色 谱 填 料 的 种 类 和 性 能 凝 胶 色 谱 填 料 的 制 备 常 见 凝 胶 过 滤 色 谱 填 料 凝 胶 过 滤 色 谱 的 应 用 体积排除色谱（SEC） ①出峰迅速，任何组分的保留体积均在Vi 和V0之间，且不需要梯度淋洗。 ②溶质与固定相（填料）和流动相之间没 有相互作用。 ③分离时不会滞留杂质或残留物在柱上， 故柱寿命长。 与其他色谱相比较的优点： ④可用于测定生物大分子的分子量 ⑤生物相容性好，有很高的活性回收率 ⑥负载量较大，利于制备分离。 主要缺点： 分辨率及峰 容量均相对 较低。 如果溶质分子的尺寸大于孔径，则只能从孔旁流过。这意味着体积较小的分子能占有更多的孔体积。这样，分子体积不同的混合物