Western_blotting 技术 实验室专用.doc

Western blotting 总蛋白的提取 收集小鼠组织或是细胞入1.5 ml离心管中。 每管加一定量的蛋白裂解液。 注：蛋白裂解液的多少以最后能得到的蛋白浓度达到10 g/l左右为佳。 用匀浆棒进行匀浆（冰中进行）。 加入一定量的PMSF，使其终浓度为1 mM。 冰中放置30~60 min。 4、12000 rpm离心30 min，上清总蛋白。可放-30保存待用。 蛋白浓度的测定（BCA试剂盒） 标准曲线的制作 配不同浓度的标准液（见表21） 表21 BSA各浓度标准液的配制 Table 2.1 Preparation of standard solution with different BSA concentration 10 mM Tris-HCl （pH=7.5） Final BSA Concentration A 700 μl 100 μl BSA 250 μg/μl B 400 μl 400 μl A液 125 μg/μl C 450 μl 300 μl B液 50 μg/μl D 400 μl 400 μl C液 25 μg/μl E 400 μl 100 μl D液 5 μg/μl F 400 μl 0 μg/μl 按50：1配Solution A：Solution B混合液，每个样本需2 ml。 在每个试管中加入2 ml Solution A：Solution B混合液以及0.1 ml 样本，于60水浴30 min。 测OD562nm，空白对照为10 mM Tris-HCl （pH=7.5），绘制标准曲线。 测样品浓度 用10 mM Tris-HCl（pH=7.5）稀释样品100倍。 加2 ml Solution A：Solution B混合液 + 0.1 ml稀释样本，60水浴 30 min。 测OD562nm。调出标准曲线，读出对应浓度值，再乘以100，即为该样品浓度。 SDS电泳 PAGE胶的制备（5%浓缩胶、10%分离胶）。 10%分离胶溶液的配制 30% Acr-Bis（29：1） 1.32 ml 1.5 M Tris-HCl (pH=8.8) 1 ml 20% SDS 20 μl 加水至4 ml，轻轻混匀，避免气泡产生。倒胶前加入20 μl的10%过硫酸铵（APS）以及2 μl的TEMED，轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间（液面最高处应在梳子下方约0.5 cm处）。然后缓慢加入1 ml去离子水，37放置30 min。待胶凝固，吸干胶上面的水。 5%浓缩胶溶液的配制 30% Acr-Bis（29：1） 0.34 ml 0.5 M Tris-HCl (pH=6.8) 0.5 ml 20% SDS 10 μl 加水至2 ml，轻轻混匀，避免气泡产生。倒胶前加入10 μl的10% APS以及2 μl的TEMED，轻轻混匀，缓慢注入两玻璃板之间分离胶的上方，加满，插入梳子。室温放置待其凝固。 蛋白样本制备 取20~100 μg的总蛋白，加入同样体积的2×蛋白上样缓冲液，于沸水中煮5 min，然后6000 rmp、2 min，取上清待用。 电泳 把做好的浓缩-分离胶板放入电泳装置中，加入1×蛋白电泳缓冲液，轻轻拔出梳子。 把蛋白样本加入加样孔。 电泳：浓缩胶70 V，分离胶140 V，直至溴酚蓝迁移至底部，停止电泳。 电转膜 准备好与胶大小一致的硝酸纤维素膜一张、两张相应大小的滤纸，将其与纤维垫放入1×蛋白转膜缓冲液中浸泡15~60 min。 按照纤维垫、滤纸、胶、膜、滤纸、纤维垫的顺序作好转膜三明治，滤纸、胶、膜、滤纸各层中要用玻棒赶尽气泡，然后放入转膜装置中。 注意放置的次序：负极（黑孔板）—→纤维垫 —→滤纸 —→胶 —→膜—→滤纸 —→纤维垫 —→正极（红孔板）。 于4、100 V转膜1~2 h。 转膜完毕后，取出膜，放入丽春红染液中染色5 min，观察转膜效果。 将膜于清水中冲洗，洗去丽春红，放入PBS，待用。 封闭 将膜放入5%脱脂奶粉（PBS配制）中，于脱色摇床中室温缓慢摇1 h。 杂交 用PBS或是封闭液稀释一抗：Rabbit-anti-Dnaic2（1：2）、Rabbit-anti-DNAI2（1：1000）、Mouse-anti-myc（1：1000）、Mouse-anti-β-tublin（1：1000）、Mouse-anti-Stat3（1：100）、Rabbit-anti-p-Stat3（1：100）或是Mouse-anti-PCNA（1：100），于37摇2~3 h或是4摇过夜。 用含1% Tween-20的PBS洗膜两次，每次5 min。 加入用PBS或是封闭液稀释的相应的二抗：HRP-Goat-anti-Mouse IgG（1：1