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植物细胞工程课件 第一章 实验室基本技术
培养容器与用具 植物细胞培养基及其配制 动物细胞培养基及其配制 动物细胞培养基及配制 动物细胞培养的营养需求特点 培养基配方及培养基选择 培养基配制 动物细胞培养液的成分及性质 氨基酸类 (1)必需氨基酸 Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Cys、Ser等 (2)非必需氨基酸 维生素类 盐类 葡萄糖 缓冲系统 大多数平衡液采用磷酸盐缓冲系统。HEPEs现被广泛使用,常用浓度为25mmol/L。 矿物类 有机补充物 如核苷类、TCA中间产物、丙酮酸盐、类脂化合物等。 激素类 如insulin、生长激素、氢化可的松等。 生长因子类 如血小板衍生出来的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、内皮生长因子及增殖刺激活性因子(MsA)等。 培养基配方及培养基选择 平衡液溶液(BSS) 天然培养液 合成培养液 无血清培养基 其他常用液 天然培养液 血浆 血清 胚胎浸出液 鼠尾胶原 合成培养液 人工方法模拟合成 如TC199、MEM、RPM-1640、DMEM、Ham’s F12等。 主要成分是氨基酸、vitamin、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质等。 无血清培养基 包括基础培养基和附加成分。 基础培养基:一般用人工合成的培养液,常用Ham F12和DMEM,1:1混合,加含15mmol/L HEPEs的1.2g/L NaHCO3作基础培养液。 附加成分: 培养基质(纤维连结素、多聚物、胶原等。) 营养成分(转铁蛋白、硒酸钠、胰岛素、生长因子等) 酶抑制剂( 0.1%-0.5%大豆胰酶抑制剂) 其他常用液 消化液 1.胰蛋白酶液 适用于消化细胞间质较少的组织,常用浓度0.25%、0.125%,T:370C或室温,pH7.4左右。 2.Na2EDTA溶液 3.胶原蛋白酶液 pH调整液 1.NaHCO3液 2.10%HAc液 3.HEPEs液 一种H+缓冲剂,可长时间保持较强的缓冲作用,维持恒定的pH值。 200mmol/LGln 抗菌液 青霉素、链霉素(双抗)液 卡那霉素液、制霉菌素液 肝素抗凝剂 培养基配制 BSS配制方法 以Hanks液为例: 按配方表准确称量试剂; 将CaCl2先溶解在100ml 水中; 其它成分依次溶解在750ml水中; 用数滴5.6%NaHCO3溶解酚红; 将2缓慢倒入3中,搅动; 将4加入5中; 将6移入容量瓶中,补足水混匀; 分装盐水瓶中,高压灭菌,40C冰箱保存。 1.血浆:选用生长1年左右的健康雄鸡,从鸡翼血管处抽取血液,在有肝素时离心(3000rpm,10min)。取上清分装入若干小瓶,低温冰箱保存。 光照包括:光周期、光量和光质三方面。 在大多数情况下,适温有利于细胞分裂,即可以提高细胞分裂速率,而适当提高温度则有利于细胞生长,在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓,而且使细胞的质量增加。 湿度条件:培养过程对湿度要求并不十分严格,因为培养的小环境中相对湿度常达110%。 周围环境的相对湿度低于60%时,培养基容易干涸,会改变培养基的渗透压;相反,若周围环境湿度过高时,培养室易滋生各种细菌和霉菌。 周围环境较适宜的相对湿度为70-80%。 1.4.2 动物细胞培养环境控制 总体上讲,动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳低温细胞在45℃下只能存活1小时,但在25℃条件下仍然能慢速生长,并维持长时间不死,甚至在4℃下数小时后,再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。 2. pH 动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4,低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长,严重时会导致细胞死亡。 培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关,一般原代细胞要求较严格,而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。 3. 溶氧及气体环境 一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平,而在对数生长期或培养后期,对溶氧水平要求增加,如果供氧不足,将导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外,还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。 4. 渗透压 动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题: 一是培养基的渗透压维持; 二细胞体内的渗透压维持。 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强,只要培养基的渗透压变化不是很剧烈,一般对培养物不会造成致命伤害。 动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。 1.5 外植体接种培养 外植体的来源 外植体(explant)是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。 用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源: 一是生长在自然环境下的植物;
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