植物细胞工程课件 第三章 细胞克隆与种子细胞筛选.ppt

细胞克隆与种子细胞筛选 3.1 细胞克隆的概念与意义 直接从机体取材的细胞、组织或器官所做的原代培养，进行传代培养后形成的一群生物学特征不均一的细胞便称为细胞系(cell line ) 。 有限细胞系（Finite Cell Line） 无限细胞系（Infinite Cell Line） 一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来。 分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法成为细胞的克隆化（cloning）。 从原代培养物或细胞系中分离单个细胞进行培养，形成均一的细胞群，这群细胞具有一定的生物学特性和遗传标记，并在继代培养中仍能保持其特性和标记，这群细胞就称为细胞株(cell strain)。 3.2　植物单细胞培养技术 3.2.1 愈伤组织诱导 　　诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀分割得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到培养基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。 3.2.2 平板培养 　　所谓平板培养（plating culture）是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体体培养基中进行培养的技术。 ? 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml。 植板：将1份已调整好密度的但细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为5mm左右。 3.2.3 看护培养 3.2.4 微室培养 3.2.5 其他改进培养技术 3.3 动物细胞克隆技术 3.3.1 原代培养primary culture 解离一般是借助酶和鳌合剂处理组织，使其成为分散的细胞。常用的酶有胰蛋白酶和胶原酶，鳌合剂主要有EDTA-Na和柠檬酸钠。 一般直接用镊子、解剖刀解剖组织、器官，然后加以整理用于培养。 不同取材方法，原代细胞培养方式亦不相同. 一般来讲，分离获得的材料多采用组织块培养，而通过解离获得的细胞材料多采用单层细胞培养和悬浮培养。 特点 直接切割分离的组织块，在一定程度上保持了原有的组织结构，对于初期体外培养的环境适应性比直接分离成单细胞要强，因此，短期组织块培养成为动物细胞培养的材料来源之一。 特点 更换培养基容易 便于观察不同条件对细胞生长的影响 培养后期容易使用灌注技术改善营养条件 细胞贴附于基底质上，更容易表达产物 单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原代培养。 在相应的培养容器内接种一定密度的细胞悬液。接种密度与细胞倍增时间有关，倍增时间在24-48h的细胞类型接种密度以105/ml细胞为宜，倍增时间在12-18h的细胞类型接种密度以2×104/ml为宜。单个培养瓶的接种体积以厚度不超过2cm为好。 3.3.2 继代培养subculture 单层细胞培养 贴壁细胞再培养 悬浮培养 非贴壁细胞培养 EDTA溶液洗涤 用PBS配制1mmoll-1d EDTA，弃去原代培养的培养液，转入EDTA洗涤细胞，然后再用0.25%的胰蛋白酶消化，次法用于贴壁性极强的细胞获取。 机械剥离 用细胞刮、细胞铲或其它工具直接剥离原代培养物。 乳鼠肾细胞原代培养 a. 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死b. 将小鼠放入盛有酒精的烧杯中数秒c. 置超净工作台内 d. 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔e. 用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱 f. 取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中 g. 用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次,尽量去掉血污. h. 将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，去净血液. 1.将洗净的组织块移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的组织块。2.加入5-8倍体积的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37℃水浴中消化20-30分钟,注意应每隔5分钟振摇一次。3.当组织块变得疏松,颜色略白时，取出置于超净工作台内. 4.用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态。 5.加入1-2ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入无菌离心管中。 1.800-1000rpm离心8-10min, 取上清加入适量培养液,细胞计数后分装；2.在细胞瓶(板)上标明细胞名称，代数，日期；3.倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37℃孵箱中培养。 培养细胞每天观察，检查：