植物细胞工程课件 第五章 细胞融合.ppt

细胞融合Cell Fusion 细胞融合（cell fusion） 用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类： 物理方法常采用射线处理，如X射线、r射线等，它们能使细胞核失活； 化学处理目前常用的试剂有： 核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(IA)； 质失活－罗丹明（R-6-G）。R-6-G是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。 对称杂种：亲本双方原生质体完全融合在一起，相互之间未发生排斥，杂种的体细胞染色体数目为双亲之和，其外部形态呈中间类型。 结果在导入有用基因的同时，也带入了亲本的全部不利基因（或性状），一个杂种中有两套不尽相关的基因并不是试验所期望的，这样常导致部分或完全不育，因而难以形成育种上的有用材料。 不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一方的部分核或质被排斥，因而其体细胞染色体数目达不到双亲之和。其外部形态呈双亲的中间型或偏一方形态，一般表现为雄性器官退化，正常花粉粒极少，育性低。 胞质杂种：携带一个亲本的核和两个亲本的细胞质。 细胞融合的意义 木本植物 eg. 柑橘 据不完全统计，通过体细胞杂交至少已获得44个种内，103个同属异种， 48个属间，5个科间的细胞杂种，其中非对称融合的体细胞杂种在90%以上。（李杰等，2003） 1980年，Butenko、Kuchko获得抗Y病毒的马铃薯杂种植株。 细胞融合的意义 5.2 融合细胞的制备 5.2.1 植物原生质体的制备 亚原生质体(subprotoplast) 核质体(nuclearplast) ? 胞质体（cytoplast） 原生质体的分离 用于分离原生质体的材料准备 酶的种类 5.2.2 动物单细胞的制备 用胰蛋白酶、机械法或二者兼用来分离细胞，对其进行单层或悬浮培养，获得单个分散的细胞。 5.3.1 生物融合法-----仙台病毒法 病毒类是研究得最早的促融剂 疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等致癌、致病病毒，都能诱导细胞融合 毒性大，应用受到限制 1958年，日本学者冈田善雄（Okada）发现了HVJ病毒可促进细胞融合。 仙台病毒（HVJ）毒力低，对人的危害小 易被紫外线或β－丙炔内酯所灭活 不同细胞融合速度不同，快的370C中5min即可。 5.3.2 化学融合法-----PEG法 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 融合过程不受物种限制。 5.3.3 物理融合法-----电融合法 　电融合法（electrofusion technique）是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，以电降解及双向电泳的联合作用为基础。 其他方法 5.4.1 动物融合细胞的选择培养技术 形态特征选择（morphology trait selection) 根据细胞或原生质体的大小、颜色、漂浮密度、电泳迁移速率、细胞繁殖状态上的差异等进行选择。 互补选择（complenetary selection） 抗性互补（resistande complenetary selection) 营养缺陷型互补（auxotroph complemetary selection） 遗传互补（genetic complemetary selection） eg2. 两个不同类型的硝酸还原酶缺失突变体烟草融合，二亲本均不能在在硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长，而杂种细胞则可以生长（Glimelius ， 1978 ）。 荧光标记选择：亲本标记不同荧光? 思考题 原生质体定义 原生质体分离、纯化方法 原生质体融合方法及原理 原生质体融合的意义 体细胞杂种鉴定方法 体细胞杂种应用实例 植物体细胞杂交过程示意图 (1) (1) (2) (3) (4) (5) 5.4.2 植物体细胞杂种选择与鉴定 杂种细胞选择系统 形态特征选择 互补选择 荧光标记选择 生长特性选择 next 大豆下胚轴 原生质体 烟草叶肉 原生质体 一半含有叶绿素，另一半含淀粉粒 补充糖 生长特性选择（growth trait selection) eg1. 粉蓝烟草 郎氏烟草 无生长素 Carlson ， 1972 eg2. Nicotiana sylvestris Nicotiana knightiana 抗卡那霉素、失去再生植株能力 有生长Callus能力、但从未形成植株 卡那霉素 eg1. eg. 异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出绿色和红色 2．体细胞杂种的鉴定 形态鉴定 细胞学鉴定 生化鉴定 分子鉴定 根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。 细胞器鉴定、染色