2010年微纳尺度分离和分析技术学术会议文章集 样品处理专题.pdf

2010年微纳尺度分离和分析技术学术会议暨第六届全国微全分析学术会议 单细胞自动分析系统及进样研究 1 2 2 *1 刘彧 ，宋大军 ，田洪孝 ，高健 （1. 山东轻工业学院，济南 250353；2. 山东省化工研究院，济南 250014 ） gaojian@ 摘要 摘要 摘摘要要：为实现单细胞自动分析，我们研究了荧光标记的单细胞受一束激光激发后，利用其发 射出的荧光信号触发同一束激光在双光路间切换的方法，实现了单一激光器在激光阀门与激 发光源两个功能间的自动转换。同时利用液压泵、电动泵结合激光阀门控制单细胞的传输， 无需借助显微镜，实现了单细胞由进样通道向分离通道引入过程的自动化。实验选取人血红 细胞作为样品，荧光素异硫氰酸酯（FITC）作为荧光标记物，研究了单细胞自动进样的条件。 关键词：微流控芯片；激光阀门；单细胞分析；自动化 单细胞分析无论对于疾病的早期诊断和治疗还是药物的设计和副作用控制都具有潜在 [1] [2,3] [4] 的重要意义 。人们已掌握了微流控芯片上进行单细胞分析的多步骤集成化 和在线衍生 等技术和方法。但这些方法仍需在显微镜下手工进行，操作复杂且效率较低。本系统基于单 一激光器在激光阀门与激发光源两个功能间的自动转换，以实现单细胞进样和组分检测等过 程的自动化。 系统由微流控芯片、智能电驱动控制仪（山东师范大学研制）、双光路激光诱导荧光检 测装置、数据采集及处理单元组成。双光路装置如图1所示，利用荧光标记的单细胞受激发 后发出的荧光信号作为控制信号，使同一激光光源既作为单细胞进样的光控阀门，又作为被 分离组分的激发光源。图中绿线和红线分别表示进样光路和检测光路。由激光器a（473nm， 上海斐波光电科技有限公司）发出的一束激光经光路转换器b反射至平面镜c，进一步反射 至平面镜d，然后到达物镜o，经物镜汇聚于微流控芯片t的通道交叉点（芯片位置可由三 维微调平台s调节），光斑大小为20μm，此为进样光路。当单细胞沿进样通道行进到通道 交叉点，细胞表面FITC受激发发射出荧光。沿激光方向发射的荧光到达物镜p，经汇聚到 达平面镜e进一步被反射至凹面镜k，然后被锥面镜l反射,经过针孔w和滤光镜m到达光 电倍增管（PMT）n，由PMT输出的信号被输入至数据采集卡v，经处理后，同时向光路转换 器b和高压电源u输出控制信号。电源接到信号后随即输出一组事先设置好的电压，控制液 流由缓冲溶液池B流向废液池BW，从而将单细胞由进样通道转移至分离通道。同时，光路 转换器中的透光孔被移至激光光束位置以使激光通过并经平面镜f，g，h反射至物镜q，最 终汇聚至分离通道末端作为激发光检测单细胞或经芯片毛细管电泳分离的组分。荧光信号经 检测光路r-i-j-l-w-m-n被PMT记录并输出至数据采集卡，最终输出记录图。完成一次循环 后，光路转换器和高压电源被置于初始位置，继续分析下一细胞。 微芯片上操控单细胞的技术已多有报道，大都需要借助显微镜利用液压、电压或磁场来 实现单细胞在微通道网络中的运输。另外，对单细胞内组分的高灵敏检测多采用激光诱导荧 光检测器。考虑到以上两点，我们仍然采用激光诱导荧光进行检测，单细胞（已被荧光标记） 的进样则可借助同一激光光束结合电渗流进行控制，我们称之为激光阀门。激光阀门的作用 在于不需要借助显微镜即可实现上述的单细胞自动进样。进样过程的单细胞荧光信号，如图 2所示。 在显微镜下观察可以看到，少数细胞聚集成团是不可避免的。而在无法观察到通道内 部的情况下，如何判断仪器自动选取的即为单细胞，是进行单细胞溶膜和组分分离之前要解 决的问题。我们采取细胞定量分散和单细胞信号辨识相结合的方法。细胞定量分散即通过细 胞计数确定细胞悬液的浓度；同时结合利用液面高度产生液体静压力而在芯片通道内形成的 鞘流，可使细胞成单行并间隔一定距离以一定流速通过通道交叉点。另一方面，从输出的荧 光信号记录图可观察到过大的信号峰，尽管单细胞存在个体差异，我们仍认为或假设过大峰 是由细胞团产生的。通过数据统计，将较小信号作为杂峰去除，过大信号作为细胞团信号去 除，选取一个响应区间输入信号采集程序，以此保证单细胞进样