缔伦光学光学显微镜二.ppt

第三章细胞生物学研究方法 上海缔伦光学仪器有限公司 本章内容提要 第一节 显微技术 一、缔伦光学光学显微镜 二、缔伦光学电子显微镜 三、缔伦光学显微操作技术 第二节 生物化学与分子生物学技术 第三节 细胞分离技术 第四节 细胞培养与细胞杂交 第一节 缔伦光学显微技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 —、缔伦光学光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 （一）缔伦光学普通光学显微镜 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ 表一、几种介质的折射率 缔伦光学显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。 （二）缔伦光学荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 （三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 laser confocal scanning microscope, LCSM LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) / （四）缔伦光学暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 （五）缔伦光学相差显微镜 原理 用途：观察未经染色的玻片标本 （六）缔伦光学偏光显微镜polarizing microscope 用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。 光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器 （与起偏器方向垂直的偏振片）。 载物台是可以旋转。 淀粉 （七）缔伦光学微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC） 1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 （八）缔伦光学倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 （九）缔伦光学当代显微镜的发展趋势 采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体。 自动化与电子化。 二、缔伦光学电子显微镜 （一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用于观察超