胚盘细胞移植法制备鸭鸡嵌合体研究.pdf

胚盘细胞移植法制备鸭鸡嵌合体 李赞东 邓 华 马玉忠 刘春海 宋永宏 王 宁 沙金危华李相芝黄劲松 中国农业大学生物学院 【摘要】本实验用胰蛋白酶处理X期麻鸭胚盘获得单离的胚盘细胞，用微注射法注 入经7线照射或未经照射的受体鸡胚盘中，共获得了11只表型嵌合体。饲养至性成 熟的鸭一鸡嵌合体(舍)与麻鸭(旱)人工受精进行后代检测，共获得622枚种蛋。其 受精率为2．9％(18／622)孵化率为1．0％(6／622)，证实了该嵌合体为性系嵌合体。 【关键词】胚盘细胞性系嵌合体微注射鸡麻鸭 禽类的卵子在输卵管漏斗部受精后，经过输卵管向下移行，受精卵开始分裂。种蛋产出 体外时胚盘已经含有6万个细胞左右，因此禽类的单细胞受精卵不易获得。且获得后用人工 黄，多精入卵，单精受精，使得雄性原核较难识别，因此在哺乳类普遍使用的基因转移技术很难 在禽类中直接使用。原始生殖细胞(PGCs)是禽类的精子和卵子的祖先细胞，起源于胚盘的上 h左右时随着下胚层的形态变化而被带到原条期的生殖新月部 胚层。以鸡为例，种蛋孵化18 位，然后进入刚刚形成并逐渐发达的胚胎血液系统循环，并在孵化50h左右时在血液中的浓 al，1976；Swift， 居，增殖分化成配子(Eyal—Gilad，etal，1981；Eyal—Gilad，1986；Fujimoto，et vitro的培养系统可以反复从胚盘中央 1914)。由于禽类PGCs具有独特的迁移路线，利用in h以上的生殖腺部位获得和移植 区，原条期生殖新月部位，胚胎血液循环系统中，及孵化72 PGCs。 代，有些文献报道在囊胚期胚盘中已鉴定出PGCs存在，因此人们认为操作囊胚期胚盘细胞同 乌骨鸡与自来航鸡之间，鹌鹑与鸡之间移植血液中PC-C岱并获得了供体的后代。Chang 受体生殖腺中定居分化为有功能的配子，也可以作为转基因的靶细胞。 微注射移植胚盘细胞或PGCs的方法都可以获得种系嵌合体。并为体外基因操作赢得了 机会和时间。相比之下，胚盘细胞移植法操作容易，易大量制备，但种系嵌合体形成比例低，而 PC_a2s移植法操作较难，不易大量制备，但是种系嵌合体形成比例高。本实验参考了上述研究 ～】08一 内容，以羽毛作为标记，供体选择了中国原种麻鸭，受体选择了纯种白来航鸡，用胚盘细胞移植 法试图制备麻鸭与鸡的嵌合体。麻鸭与鸡是遗传距离较远的动物，若能制备出嵌合体，此模型 将有望应用于濒危鸟类的挽救及禽类转基因研究中。 1材料与方法 1．1材料 供体麻鸭种蛋购自中国医科院药用植物研究所鸭场，受体白来航纯种父母代种蛋购自北 ’ 京种禽公司。 SMZ一10实体显微镜购自日本 小型孵化器为日本Syowa孵化机研究所产品，Nikon Nikon公司，研磨器为13本Narishige产品。 1．2方法 1．2．1麻鸭胚盘细胞的分离新鲜的麻鸭种蛋用75％酒精擦拭消毒后采取胚盘，用0．25％ 胰蛋白酶处理获得单离胚盘细胞(Ono，1993)。 1．2．2受体胚盘的准备新鲜的自来航种蛋用上述方法消毒后分为两组：I组用67线 gy 处理，Ⅱ组未经7线处理。． 。 1．2．3胚盘细胞的移植在鸡蛋壳上打一直径3—5 mm小窗，暴露胚盘。用直径80／an左 000—2 右的微玻璃针吸取1—2出细胞悬浮液(含1 000个胚盘细胞)注入鸡胚盘的中央区 域，密封。 1。2。4鸡胚的体外培养(改良的Naito，1990方法) 蛋2次的