16组织和细胞培养技术课程教案628.doc

大连医科大学药学院 教 案 教研室： 药理学 教师姓名： 王丽 课程名称 组织和细胞培养技术 授课专业、年级 药学 授课内容 第十一章 细胞培养在细胞衰老、凋亡研究中的应用 学 时 4 大纲要求 1.掌握细胞凋亡与细胞衰老的概念和区别 2.掌握细胞凋亡的研究方法 3.了解细胞衰老的研究方法 教学重点 细胞凋亡的研究方法 教学难点 抗凋亡研究与细胞衰老的研究 教学方法 多媒体课件＋板书 教 学 内 容 大体内容与时间安排，教学方法： 1. 细胞凋亡的研究方法 60分钟 2. 抗凋亡研究 40分钟 3. 细胞衰老的研究 60分钟 第11章细胞培养在细胞衰老、凋亡研究中的应用 细胞凋亡（apoptosis） 细胞凋亡的意义： 1、确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成 2、维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞 3、防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡 是生理性、主动性过程。确保正常发育，生长，维持内环境稳定，发挥积极的防御功能 衰老（aging)：机体的形态、结构和生理功能逐渐衰退的现象。 凋亡与的区别： 凋亡： 1.细胞可由G1期进入S期， 启动DNA合成 2.需要细胞早期的基因表达 衰老： 细胞生长发生停滞，不能进 入S期 第一节 细胞凋亡的常用研究方法 细胞凋亡诱导剂： 化学诱导剂：H2O2、化疗药物 物理性因子：放射线、UV 生物因子：Anti-Fas TNF Trail 一、细胞凋亡的形态学研究方法 （一）光学显微镜 台盼蓝染色 Giemsa染色 形态学特征： 1.细胞发泡 2.染色质浓缩 3.边集现象 4.凋亡小体 （二）荧光显微镜观察 1. 活细胞的Ho蓝色荧光最强 2. 凋亡早期：Ho蓝色荧光较弱，有较弱的PI红色荧光 原因：DNA降解和丢失 凋亡晚期：PI红色荧光加强 3. 坏死细胞PI红色荧光最强，蓝色荧光较弱 注意事项: 1. 阴性对照：用不加染料的正常培养细胞 2. 在PI染色时不能先固定细胞，否则不能将凋亡细胞、坏死细胞以及机械损伤细胞严格区分 3. 在Ho染色时温育时间决定Ho的吸收，通过预实验决定温育时间 （三）电子显微镜观察 细胞凋亡与细胞坏死的区别 特征 细胞凋亡 细胞坏死 诱导因素 受累范围 膜完整性 细胞体积 染色质 细胞器 溶酶体 细胞形状 基因组DNA 大分子合成 基因调控 后果 意义 生理及弱刺激 单个细胞丢失 保持到晚期 减少、固缩 凝聚成半月形 无明显变化 保持完整 形成凋亡小体 有控降解 一般需要 有 不引起炎症反应 生理死亡方式 强烈刺激 成群细胞死亡 早期即丧失 增大肿胀 稀疏成网状 肿张破坏 破坏外溢 破裂成碎片 随机降解 不需要 无 引起炎症反应 病理死亡方式 二、细胞凋亡的生物化学检测方法 1. 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 2. 线粒体膜势能的检测 JC-1 3. DNA片断化检测 DNA Ladder 测定 DNA含量分析 4. TUNEL法 细胞凋亡的主要特征是形成大小为180～200bpDNA ladders，凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG（tissue TransglutaminasetTG是依赖于钙离子的酶，在正常细胞中，由于Ca ++浓度较低，tTG的活性较低，当凋亡起始时，Ca++浓度上升，从而使tTG活化。其作用是保持凋亡小体的完整性，防止有害物质的逸出 DNA ladders的观察 （一）超速离心 用氯化铯（CsCI）连续梯度超速离心＋EB染色（ethidium bromide，溴化乙锭）→45000转/min 16-24小时→条状粉红染色条带。 （二）琼脂糖凝胶电泳法 将凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可以发现其DNA片段呈间隔180—200bp的阶梯状电泳条带，而未凋亡的DNA无降解，电泳条带表现为一大分子片段。 （三）末端标记电泳法 核素标记3’末端→凋亡细胞中提取DNA→放射性自显影 优点： 敏感度高 在密度仪测定下进行定量和半定量检测 三、细胞凋亡的免疫化学分析法 （一）TUNEL测定法（DNA断裂的原位末端标记法） 染色体DNA断裂产生大量粘性3‘-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素衍生物标记到DNA的3’-末端，进行凋亡细胞检测的方法称脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）DNA的断裂，