2-2电泳技术.ppt

（二）DNA的迁移速率决定因素 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3 DNA的构象 超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖； 不同类型琼脂糖的性质 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 （二） 凝胶载样缓冲液 6×凝胶载样缓冲液 （三）琼脂糖凝胶中DNA的检测 1 凝胶的EB染色 使用EB染色注意事项 （1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 （4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。 2 凝胶SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。 （四） 凝胶中DNA的成像 （五） 凝胶中DNA的回收 在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。 CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺） （二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。 （三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 优点：操作简单、重复性好、样品易回收 缺点：分辨率较低 * * * * 优点：样品不易扩散、分辨率高，重复性好、可用于小量的分离鉴定及较大量的分离制备 缺点：未聚合的丙烯酰胺有毒性、凝胶聚合易受影响 * * * * 从人的体液和其他组织细胞的样品中分离出代表一个人的独特基因组成的一系列谱带，从而能比较准确地鉴别罪犯 * 通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。 可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。 现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题： 1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA 样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离的主要依据 凝胶是由丙烯酰胺聚合而成 主要用于蛋白质的分离分析 （一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质 12 45 6~100 20.0 15 60 25~150 15.0 20 70 40~200 12.0 45 160 60~400 8.0 65 260 80~500 5.0 100 460 1000~2000 3.5 溴酚蓝 二甲苯氰FF 有效分离范围（bp） 丙烯酰胺浓度（%） 注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; 蛋白质样品处理 十二烷基硫酸钠（SDS） PAGE电泳装置 PAGE的结果观察 考马斯蓝染色 凝胶成像仪扫描 生物大分子的分离鉴定 核酸序列测定及比较 蛋白质的相对分子量测定 电泳技术的生物学应用 药物分析 药物的组分分析、成分提取 药物-蛋白质相互作用研究 兴奋剂检测 电泳技术的生物学应用 临床检验 血清蛋白电泳 了解患者血清蛋白质全貌，可作初筛实验 血红蛋白及糖化血红蛋白电泳 指导贫血病分型诊断与治疗 尿蛋白电泳 辅助判断肾脏的病变程度 脑脊液蛋白电泳 脊髓炎等疾病的诊断 电泳技术的生物学应用