E coli pUC19质粒的提取、纯化与检测.doc

实验一 E. coli pUC19质粒的提取、纯化与检测 一、实验目的 染色体DNA与质粒DNA(Plasmid)两类，其中质粒是一种环状的双链DNA分子，是pUC19质粒该菌株的碱基大小约为2.69kbp。 2. 碱变性法提取质粒DNA碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。DNA（cccDNA）的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.6的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型在溶液中而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，以不同的速率通过介质运动而相互分离。溴化乙锭（EB）能双链DNA利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。实验材料DH-5α受体菌（pUC19质粒）。UC19质粒 （TaKaRa公司产品） 2．培养基和试剂?LB培养基液体胰蛋白胨 10g,，酵母粉5gNaCl 10g；加蒸馏水溶解，用NaOH调PH 至7.，加水至1000 ml高压灭菌15高压灭菌15②抗生素：氨苄青霉素（ampicillin），配制成100mg/ml备用。 50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0)，10 mmol/L EDTA (pH=8.0),。高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。 ④溶液Ⅱ：200 mmol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH母液加无菌水稀释），1％ SDS（从20% SDS母液中稀释），现配现用。 ⑤溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60mL，冰醋酸11.5mL，重蒸水28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。?⑥TE缓冲液：10 mmo/L Tris-Cl (pH=8.0)，1 mmol/L EDTA (pH=8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 ⑦RNase A母液：将RNase A溶于含10mmol/L Tris-HCl (pH=7.5)和15mmol/L NaCl的溶液中，配成10mg/mL溶液，100℃加热15min 冷却后分装至1.5mL无菌离心管，-20℃保存。 ⑧3 mol/L NaAc 。 ⑨饱和酚。 ⑩氯仿/异戊醇混合液：氯仿：异戊醇（体积比）24：1的比例在氯仿中加入异戊醇。 ?预冷的无水乙醇、70%乙醇。 6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）10×TAE电泳缓冲液（40mTris ,20 mmol/L NaAc,1mmol/L EDTA PH=8.0）琼脂糖Agarose)。 1×TAE缓冲溶液，用量筒量取40mL 50×TAE缓冲溶液 定容至2L，得到1×TAE缓冲溶液，供全班使用。 溴化乙锭水溶液（10mg/ml ）器材 ????接种针10ml移液管??量筒、冰块、牛皮纸、线绳、纱布、棉花、塑料手套、乳胶手套、酒精灯。 电子天平，恒温振荡培养箱、高速冷冻离心机、台式离心机、漩涡振荡器、微波炉、电泳仪、紫外灯（紫外观察仪）。 ?Eppendorf离心管（50mL、1.5mL）、微量移液器（1000μL量程、50μL量程、10μL量程）、移液器枪头（蓝、黄）、制胶槽、电泳仪、18孔梳子。 ????? 四、实验步骤 1．实验准备 按照实验材料试剂列出的清单和配制方法，进行试剂的配制（配制完成后灭菌或冷冻保存）和实验仪器的准备。 2．细胞培养 在含有Ampr的LB平板上接种含pUC19质粒的E. coli DH-5α菌株，37℃下培养过夜。 Ampr上寻找生长良好的菌落，转接到50mL 含Ampr的LB液体培养基中，37℃，150rpm振荡培养过夜。 取菌液以50%接种量接种于新的LB液体培养基中，37℃，150rpm振荡培养4~6h至菌体生长至对数期备用。 3．质粒DNA提取 取50mL离心管，称得其重量W1=14.265g；将细菌培养得到的菌液加入离心管，至液面距管口1.5—2.0cm；6000rpm，4℃，离心5min，弃上清液。 用移液器移取5mL溶液I，在漩涡振荡器