T细胞培养.doc

主要有 分离淋巴细胞、补液、装袋、分袋、收获等步骤。 细胞培养日程如下： 第一天 分离淋巴细胞 第四天 补液50ml 第五天 补液140ml 第六天 装袋 第十天 第一次分袋 第十四天 第一次收获 第二次分袋 第二十天 第二次收获 第三次分袋 第二十六天 第三次收获 1 分离淋巴细胞 以100ml外周血为例，如血量不同，可按此操作规程做相应调整。 患者100ml外周血，室温1200rpm离心10分钟（刹车ON）。将上层血浆转入离心管-40℃保存。 用生理盐水1：1稀释血细胞沉淀(生理盐水：原全血体积=1：1)，用移液管吹打混匀后小心加到用50ml离心管分装的15ml Ficoll层上，使分层保持清晰，每管约35ml。室温2000rpm离心20分钟（刹车OFF）。 尽量吸尽两液面交接处的细胞层，均分到3个干净的50ml离心管中，用RPMI-1640液补充至50ml混匀，室温1600rpm离心10分钟（刹车ON）。 倾去上清，将各离心管细胞沉淀振荡开后用10mlRPMI-1640悬浮合并为一管，混匀后取10μl与Turk工作液（1:10）混合，避光反应15min后再加10μl胎盘兰10倍稀释计数。剩余液体再加RPMI-1640至50ml，室温1200rpm离心10分钟（刹车ON）。 倾去上清，将细胞沉淀振荡后加RPMI-1640培养液50ml重悬，室温1000rpm离心10分钟（刹车ON）。 弃上清，振开管底细胞沉淀后用细胞培养基 50ml重悬细胞。取一新的细胞培养瓶，用移液管吸干瓶中的缓冲液。将细胞加到培养瓶中，同时加入800μgSM蛋白。将内有细胞悬液的培养瓶放入CO2培养箱，拧松瓶盖，查看培养箱状态，确保正常。温度：37± 0.5、湿度：大于90％、CO2浓度：7.5±0.5％μl/皿吸取细胞悬液加入相应检菌平皿。 将细胞培养瓶和选择性培养平皿从安全柜取出，其中培养瓶放入二氧化碳培养箱，拧松瓶盖，并小心将培养瓶放平。查看培养箱状态。 将加好样品的血琼脂平板正置（盖子在上，包被选择性培养基的玻璃皿在下）放入35℃恒温霉菌培养箱，记录放入时间及培养物品。隔夜后倒置，保留48小时。 3 细胞装袋 （1）拧紧瓶盖从CO2培养箱内取出细胞培养瓶，与其它所需材料一并表面消毒后，移入生物安全柜，静置5分钟。 （2）拍打瓶壁使细胞尽量从瓶底脱落。 （3）用移液管吸取少量细胞悬液放入计数管中（500μlEP管），再从中吸取10ul悬液放入一个新的计数管，加入20ul EDTA缓冲液反应2min，然后加入10ul胎盘蓝染色计数细胞，稀释总倍数为4倍。 （4）数量合格后进行后续处理，培养瓶内细胞处于0.9-1.4×106cells/ml时最适宜进行装袋操作，如数量过低应将培养瓶放回培养箱，延迟后续操作。 （5）打开培养袋包装，做好标记，注明病人姓名、CD8+T细胞编号、操作项目名称、日期等。然后撕开细胞培养袋细管子管口的封套并与已拔出内芯的60ml注射器头连接好，再将瓶中的细胞悬液也通过注射器全部倒入培养袋中，并加细胞培养基750ml，用封管器封闭管口。 （6）在可插针头的管子顶端的培养袋取样口用5ml注射器抽取约0.5ml含细胞培养基加至血平板上检菌，做好标记，注明病人姓名、细胞编号、操作项目名称、日期等。 （7）将培养袋放入细胞培养箱，并观察培养箱运行状态，确认正常。 4 细胞分袋 从4℃冰箱取出一只细胞培养袋，表面酒精消毒后，移入生物安全柜，打开包装，做好标记，注明病人姓名、细胞编号、操作项目名称、日期等。 撕开细胞培养袋细管子管口的封套并与已拔除内芯的60ml注射器头连接好，将用1000ml细胞培养基全部通过注射器倒入袋中，用热合封管机相隔1厘米连封两道将管封死。 用无菌接合器连接装有细胞的原细胞培养袋1和新装培养基的细胞培养袋2的细管子，将细胞培养袋1挂在铁架台上，利用重力将两袋中的液体都集中到细胞培养袋2中，混匀。 将空的细胞培养袋1放到天平上，将细胞培养袋2挂在铁架台上，将细胞悬液平均分到两袋中，即当天平显示细胞培养袋1重量约为1000g时将连接在一起的细管子从中间接口处用止血钳夹住，用封管器在血钳夹左右各封2段，从中间两个封管处将跨越细管子接口处的那段剪下。两个细胞培养袋一分为二。 在细胞培养袋1管子前端的取样口用5ml注射器抽取约0.5ml检菌，做好标记，注明病人姓名、CD8+T细胞编号、操作项目名称、日期等。 将两个培养袋放入细胞培养箱，并观察培养箱运行状态，确保正常。 将加好样品的血平板放入37度恒温检菌培养箱内，48小时后观察结果。 5 细胞收获 检查所要收获的细胞培养袋标记是否与培养回输计划相符。 如新开250ml离心管外包装，则需将每个离心管瓶盖隔外包装拧紧。撕开外包装，取四个250ml离心管插入离心管架。 将此项