《基因工程原理》教案.docx

《基因工程原理》教案（二O一二年修订稿）安徽大学生命科学学院第一章 绪论重点：基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中的地位和作用。难点：基因工程与遗传工程的区别。（一）前言生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等4个部分。（二）什么是基因、基因工程应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝或其表达产物。（三）基因工程的主要内容目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定（四）基因工程的历史及我国开展基因工程的现状第二章 基因工程的基本操作技术重点：PCR技术和基因定点诱变技术。包括PCR技术的原理，反向PCR与染色体步移，不对称PCR与DNA序列测定，PCR与RAPD，RT-PCR与RNA分析；基因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物诱变和PCR诱变。难点：酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序。（一）凝胶电泳技术在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳脉冲场凝胶电泳RNA电泳（二）细菌转化技术转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法； 电穿孔法（三）核酸杂交技术所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。Southern blot；Northern blotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落原位杂交注意比较（四）DNA序列分析技术（四）DNA测序分析DNA链末端合成终止法：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；② 该酶能够用2，3--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5→3外切酶活性。Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)：该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization)：如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。用一组已知系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶DNA分子杂交，从而测定其序列。（五）基因的化学合成（六）PCR技术PCR反应体系的设立PCR反应程序设计引物设计原理PCR技术应用（七）基因定点诱变技术使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。 盒式诱变（cassette mutagenesis）包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。寡核苷酸引物诱变 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分PCR诱变：重组PCR定点诱变、大引物诱变（八）DNA与蛋白质相互作用凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），又称DNA迁移率变化试验（DNA mobility shift assay，DMSA）：DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合DNaseI印迹试验（DNaseI foot printing） 用于检测与蛋白结合的DNA序列的部位及特性，形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。甲基化干扰实验：根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化，但仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以