分子生物学原理及技术在结核病中的应用.ppt

M. tuberculosis genome sequence How to find function? Conserved Asp and Glu residues 2. “Unknowns” DNA序列测定 应 用 结核分枝杆菌耐药基因型鉴定 不仅能用于细菌基因突变的检测，而且能够确定其突变的部位与性质，是检测基因突变的最可靠的方法。目前，DNA序列测定已作为从基因水平进行MTB耐药性测定的金标准。 结核分枝杆菌菌种鉴定 利用PCR-DNA序列分析技术，即利用PCR扩增待测基因，以荧光素为标记物，然后用测序仪测序，根据所得结果即可将待测菌株分型。PCR-DNA可灵敏、快速、可靠地测定分枝杆菌种特异型核苷酸序列，目前，用于菌种鉴定的核苷酸序列主要有16SrRNA和65kD蛋白编码基因。 DNA探针技术 核酸探针是指用放射性或非放射性物质标记已知的DNA或RNA片段，然后用这种已知的核酸探针检测样品中未知的核苷酸，如有完全互补的核苷酸序列，则按碱基互补的原则结合，形成稳定的DNA：DNA或RNA：RNA复合物，再经显影、显色或荧光检测的方法，将结合核苷酸的位置或大小显示出来。核酸探针技术的显著特点是高度的特异性，可用于结核病的诊断、菌种鉴定和耐药性检测等方面，但它的灵敏度不够理想，标本中至少需要104～105个细菌的DNA才能检测出来，而且不能直接检测标本，所以一般将它和其他的技术结合起来使用，如将它和敏感性高的核酸体外扩增技术相结合已成为结核病诊断和研究的重要手段。 基因芯片技术 DNA芯片、生物芯片，是分子生物学最前沿的方法。 基本原理：将大量探针分子（指已知的DNA或RNA片段）固定在支持物（玻璃、硅片等）上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获得样品分子的数量和序列信息。 该技术是将大量探针同时固定在支持物上，可一次性对样品大量序列进行检测和分析。 在结核分枝杆菌的研究种可用于菌种的鉴定、耐药性的检测，基因组比较分析。 国内外有多家单位用该法检测研究结核菌耐药性，但由于芯片制备比较复杂；样品的处理比较繁琐；需要昂贵的仪器，检测成本高，临床实验室很难推广使用。 IS6110 RFLP DNA fingerprinting 根据结核分枝杆菌基因组中存在插入序列IS6110的数目和位置不同，利用限制性内切酶切割IS6110上相应位点并电泳分离，可以得到类似指纹（Fingerprinting）样的特征性条带，这些条带被称为IS6110 RFLP DNA指纹，该项技术为研究结核分枝杆菌基因分型奠定了基础。 Mycobacterium tuberculosis IS6110 RFLP DNA Fingerprinting Spoligotyping Spoligotyping是间隔子寡核苷酸分型法，根据在结核分枝杆菌中存在直接重复区域（Direct Repeat DR区），DR区间的寡核苷酸序列呈多态性而构建的。 具体方法为：采用PCR的方法扩增结核分枝杆菌基因组DNA DR间隔区，引物为DRa: 5’-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3’, DRb: 5’-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3’。且DRa 5‘末端标记有生物素。PCR产物与已知固定在膜上的43个DR间隔区进行杂交，通过增强化学发光试剂盒进行检测。 Variable number tandem repeat (可变数目串联重复 VNTR) 每个特定的VNTR位点由两部分组成，即中间的核心区和外围的侧翼区。核心区含有至少一个以上称为重复单元的短序列，一般该重复单元的碱基对数目不变，而串联在一起的重复单元的数目是可变的。 Jinghua2_1(ETRA) 非经典 PCR技术的应用 逆转录PCR RNA在逆转录酶的作用下逆转录为cDNA，然后对cDNA进行PCR，细胞中rRNA的数量是DNA的100倍，因此扩增产物增多，灵敏度提高。该法敏感性和特异性均高于经典PCR，可用于结核病的诊断，但无法区别死活菌。 巢式PCR、半巢式PCR 巢式PCR采用内外两对引物，两次扩增。半巢式PCR是由巢式PCR发展而来，主要是内引物的不同。 PCR-单链构象多态性分析（SSCP ） 用于检测结核分枝杆菌的耐药性。其原理主要是PCR产物是两条互补单链，各单链的碱基序列不同而形成不同的空间构象，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，单链DNA泳动速度即取决于DNA的长度，也决定于其序列组成与空间构象。如果单链DNA某一片段的碱基序列发生突变或存在