分子生物学检验技术-第十一章 分子生物学检验技术的临床应用.ppt

荧光ＰＣＲ原理 荧光信号的种类 荧光染料直接结合扩增产物 荧光标记引物 特异性荧光探针 荧光信号的产生 Fluorescence resonance energy transfer ( FRET ) 荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。 荧光信号的淬灭-FRET原理 Taqman探针 Taqman探针技术 结果分析的两重要参数 荧光阈值（threshold ）：荧光本底设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 Threshold and Ct 定量原理和方法 原理：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析.。 外标法：将几个已知拷贝数的纯化的目的基因标准品进行FQ-PCR 扩增，绘制荧光定量标准曲线。 内标法：将已知浓度的内标基因加到各标本中，与标本一起经历核酸提取、加样、逆转录、PCR扩增及信号检测的全过程，比较内标最后的实测值与已知值，以检验标本中是否存在抑制PCR的因素，也可对样品的拷贝数加以校正。 外标法 未知样本拷贝数的确定 基于其它探针的荧光PCR原理 SYBR green I 染料 Taqman-MGB 探针 Molecular beacon 杂交探针技术 置换探针技术 SYBR green I 染料 Taqman-MGB (Minor Groove Binder) Molecular beacons Molecular beacons Molecular beacons 杂交探针技术 杂交探针技术 置换探针技术 荧光PCR技术的特点 特异性强 灵敏度高 在线式实时监测荧光量变化，摒弃常规PCR受多因素干扰的终点分析法，使定量更准确可靠 全封闭反应，不需PCR产物后处理，避免了模板的污染隐患 可实现单管双检或多检 不接触有毒试剂，操作安全 荧光ＰＣＲ技术应用举例 SureDT志贺氏菌实时荧光PCR检测试剂的研制 志贺氏菌简介 志贺氏菌分为福氏志贺氏、鲍氏志贺氏、痢疾志贺氏、宋内志贺氏四大类，其引起的细菌性痢疾，又称志贺菌病，主要通过消化道途径传播。 志贺氏菌病在全世界范围分布，估计每年有16,470万例病例，大多数发生在发展中国家，有110万人因此而死亡。在所有发病人数中有69%是不满5岁的儿童。 志贺氏菌国标法检验程序 靶基因的确定 文献检索表明，ipaH基因是志贺氏菌的特异序列，该基因决定志贺氏菌对大肠粘膜的上皮细胞侵的袭能力。 以ipaH基因为检测靶基因的普通PCR检测法可以检测出全部四种志贺氏菌和少量大肠杆菌。 通过对ipaH基因序列的排序和比对，发现该基因有一段序列在志贺氏菌内高度保守，相对于其它物种则高度特异，符合靶基因及引物探针的设计要求。 靶基因ipaH序列Blast比对结果 ipaH基因扩增片段比对图 引物和探针的设计示意图 荧光PCR检测梯度稀释扩增结果 实时荧光PCR及国标法实际样本检测结果 谢谢大家 SFipaHpr863 3’ Sense DNA 5’Antisense DNA SFipaHpf771 SFipaHpb802 5’ 3’ ipaH * * 第十一章 分子生物学检验技术的临床应用 荧光PCR原理与应用 试剂盒的组装 同类产品对比试验 国标法对比试验 试剂盒 样本收集 引物和探针组合 核酸提取 基因序列分析 病原菌培养 引物探针设计 病原菌分离 保守区段选择 检测体系的初步建立 文献检索 阴性对照 阳性对照 反应条件优化 扩增片段克隆 最佳反应体系 最佳引物探针组合 特异性试验 灵敏性试验 研究的技术路线 非志贺氏菌 生化分群试验 志贺氏菌属分群及分型结果 葡萄糖铵试验、西蒙氏柠檬酸盐、赖氨酸、尿素、KCN、水杨苷和七叶苷 葡萄糖铵 + 或任何其他阳性结果 非志贺氏菌 报 告 检 样 25g + GN 225ml HE琼脂或SS 麦康凯或EMB 36±1℃,6~8h 36±1℃,18~24h 挑取可疑菌落 TSI，葡萄糖半固体 TSI底层产酸，斜面产碱，H2S—，不产气，无动力 非如左述的各种反应结果 血清学分型 进一步的生化试验 荧光PCR检测 *