基因工程-2章 基因工程工具酶.ppt

3.单链核酸内切酶 S1核酸酶 S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌 降解单链DNA速度比降解双链DNA快75000倍 Zn2+必需 最适pH范围为4.0-4.3 需要NaCl 10-300mmol/L 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 * * S1核酸酶在基因工程中的用途 去除DNA片段的单链突出端，使之成为平端，利于某些情况下片段之间的连接； 去除cDNA合成时形成的发夹结构； 施行S1核酸酶保护试验，分析转录产物； 成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合S1核酸酶水解，可确定内含子在基因组DNA中的定位； 修整渐进性删除突变的末端。 * * * * * * * * (四)核酸修饰酶1.碱性磷酸酶(alkaline phosphatse) * * * * * * 2.T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP） * * * * 本章重点掌握的内容 概念： DNA的物理图谱、同裂酶、同尾酶、核酸外切酶、限制性内切核酸酶、限制性内切核酸酶星活性、宿主的限制与修饰。 影响Ⅱ型限制性内切核酸酶酶活性的因素。 简述Ⅱ限制性内切核酸酶的作用特点。 T4 DNA连接酶作用机制。 常用基因工程工具酶的功能及其用途。 Ⅱ型限制性内切核酸酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因。 Klenow酶的基本性质及用途。 S1核酸酶在基因工程中的用途。 * * * * * * * * 11.DNA的物理图谱(限制性酶切图谱) 是指某些限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置，表现出一些部位的线性序列，它是DNA分子结构特性的反映。 图谱的大小和切点的距离根据DNA片段的长短直接用bp或kb来表示。 是从分子水平上探讨基因结构、核苷酸序列、基因表达调控等生物功能的基础，是分子克隆、生物进化研究、医学上遗传性疾病机制的研究和诊断等的有效工具。 * * 用部分酶解法测定DNA物理图谱包括两个基本步骤: (1)完全降解：选择合适的限制性内切酶将待测DNA链(已经标记放射性同位素)完全降解,降解产物经凝胶电泳分离后进行自显影,获得的图谱即为组成该DNA链的酶切片段的数目和大小。 (2)部分降解：以末端标记使待测DNA的一条链带上示踪同位素,然后用上述相同酶部分降解该DNA链,即通过控制反应条件使DNA链上该酶的切口随机断裂,而避免所有切口断裂的完全降解发生。部分酶解产物同样进行电泳分离及自显影。 比较上述二步的自显影图谱,根据片段大小及彼此间的差异即可排出酶切片段在DNA链上的位置。 * * 三、其他基因工程工具酶 (一)DNA聚合酶(DNA polymerase) * * DNA聚合酶作用的条件与共同性质: ①要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA,产物的性质与模板编码相同； ②必须有模板； ③必须有引物指示合成起点，即提供3’-OH末端，不能自行起始合成新的DNA链； ④催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-OH末端，DNA合成的方向是5′→3′。 * * 1.大肠杆菌DNA聚合酶I(DNA polymerase I) * * * * 基本用途 2.大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow fragment) ⑴Klenow酶的基本性质： 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得C端三分之二的大肽段, 即Klenow酶。 * * DNA Pol I 的三种酶活性区域 * * 323个氨基酸 小片段 5????核酸外切酶活性 大片段/Klenow片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 ???5?核酸外切酶活性 N 端 C 端 枯草杆菌蛋白酶 DNA-polⅠ Klenow片段是实验室合成 DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。 ⑵Klenow片段的基本用途： 补平限制性内切核酸酶切割DNA产生的??凹端。 用[32P]dNTP补平DNA的??凸出末端，对DNA片段进行末端标记。 对带??凸出端的DNA片段进行末端标记。 在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链。 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA。 应用双脱氧末端终止法进行DNA测序。 * * * * * * 3.T4 DNA聚合酶(T4 phage DNA polymerase) （1）T4 DNA酶的基本特性： 无5`→3`的核酸外切酶活性。 它需要一条有引物的单链DNA作模板。 具有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3`的DNA聚合酶活性。 在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切。 －取代反应:在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。　 －聚合反应:在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。 * * （2）基本用途 以聚合反应标记带有5`末端的dsDNA; 以取代反应标记末端或平端的dsDNA; 借其3`→5`外切