trap提端粒酶的原理.doc

基本原理 利用端粒酶在体外可以以其自身RNA 的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列的特性，采用PCR 方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。1994 年Kim 建立的TRAP 法，其主要原理如下：首先合成一个18nt 的TS 做上游引物，端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG，然后每经过一次转位合成一个ggttag 的6 碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX 做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。 我公司提供的PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp 的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP 法灵敏度高、特异性强等优点，避免了同位素的放射污染。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使PCR效果进一步提高，使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。 基本原理 利用端粒酶在体外可以以其自身RNA 的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6 个碱基的重复序列的特性，采用PCR 方法扩增此重复序列，并进而用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳显示6 个碱基差异的梯带。1994 年Kim 建立的TRAP 法，其主要原理如下：首先合成一个18nt 的TS 做上游引物，端粒酶结合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG，然后每经过一次转位合成一个ggttag 的6 碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入CX 做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。 我公司提供的PCR端粒酶活性检测试剂盒基于同样的的原理，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp 的梯状条带，条带的多、寡、深或浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP 法灵敏度高、特异性强等优点，避免了同位素的放射污染。同时，还增设了内标准物，提供阳性对照品，优化了引物设计，使PCR效果进一步提高，使之能够高灵敏的检测到细胞和组织提取物中端粒酶的活性。 TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂实验方法 试剂盒组份 组分 50 次实验量 Wash buffer 11ml Lysis buffer 2.2ml 10×PCR buffer 140μl dNTPs 165μl Primer1 165μl Primer2 28μl Primer3 110μl Taq -DNA Polymerase 17μl ddH2O 750μl 阳性对照模板 55μl 内标准模板 55μl 操作步骤 1、端粒酶的提取 ⑴ 手术后取下的活组织，立即保存在液氮之中。 ⑵ 40～100mg 冷冻(-70%℃)组织用无菌眼科手术剪尽量剪碎，研磨器研磨，加入40 ul Lysis buffer(使用前每ml Lysis buffer 加入2μlβ-巯基乙醇);或1～2×106 沉淀细胞直接加入40μl 预冷的Lysis buffer，悬浮细胞，涡旋振荡10s, 置冰浴中30min，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6 次。 备注：为了获取比较理想的端粒酶提取液，建议在一些干硬组织中适当加入Washbuffer。 ⑶ 4℃离心(13000rpm,20min)。 ⑷ 移取上清，分装3-4 管，每管约20μl。其中一份样品用于蛋白质浓度定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。 2、 PCR 扩增(1×25ul) Ⅰ液(μl) Ⅱ液(μl) ddH2O 7.5 5.5 10×buffer 0.5 2 dNTPs 0.5 2.5 Primer1 0.5 2.5 Primer 2 0 0.5 Taq-DNA polymerase 0 0.3 内标准模板 1 1 Primer 3 2 2 3、 PCR 扩增： ⑴ 每管加入Ⅰ液9μl 及端粒酶提取液1μl，混匀，30℃反应30min。 ⑵ 上述各管93℃加热1min 灭活。 ⑶ 向上述各管中加入预热至93℃的Ⅱ液各13ul，混匀，进行第一步扩增。扩增 条件如下： 第一步： 步骤 时间 温度 预变性 3m 93℃ 变性 35s 93℃ 退火 35s 42℃ 延伸 90s 72℃ 循环数 5 延伸 60s 72℃ ⑷ 在第一步扩增最后一个循环的延伸一步的最后几秒，暂停仪器运行，快速向各管中加入primer3 2ul 和内标准模板1ul。继续运行仪器，进行第二步扩增。扩增条件如下： 第二步(连接第一步)： 步骤 时间 温度 预变性 60s 93℃ 变性 40s 93℃ 退火 40s 60℃ 延伸 50s 72℃ 循环数 36 延伸 8m 72℃ 4、 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(所有溶液，用户自备) ⑴ 制备1