荧光光度分析法.ppt

第4步：(从对话框中， a. 点击选项(Options)，进入选项(Options)页面 b. 输入坐标轴的最小和最大荧光强度值Y值。 c. 设定激发滤光片(Excitation filter)，建议设定为自动(Auto)模式（默认模式）。系统将依据所选择的激发光波长，把滤光片的轮子自动地移动到合适的位置。 d. 设定激发滤光片和发射滤光片(Emission filter)，为了减少设定次数，建议发射滤光片设定为打开(Open)模式。 e. 设定EHT或样品检测器的光电倍增管。设定值取决于样品激发荧光的强弱，例如，对强激发的样品，建议设定为较低(Low)值；而对弱激发的样品，建议设定为较高(High)值。 第5步： 点击附件(accessories)，确保所有附件选项未被选定。 第6步： a. 点击标准(Standards)，进入标准(Standards)页,设定与数据采集有关的标准参数。 b. 设定合适的单位(Units)。 c. 在标准(Standards)栏中，输入标准样的数目。 d. 然后在浓度(Conc)栏中，输入每一个标准样的浓度。 e. 选择校准所需的曲线类型(Fit Type) f. 在Min（最低）R2中输入所需的R2值或相关系数。该值越接近1.0000越好，经典值为0.9500 荧光光度分析法 一、基本原理 　　　在紫外光或波长较短的可见光照射后，一些物质会发射出比入射光波长更长的光 --------荧光。以测量荧光的强度和波长为基础的分析方法叫做荧光光度分析法。 1.荧光的定义 　　　假设分子在吸收辐射后被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于较高振动能级上的分子，很快地（约10-12 ~ 10-14 s）发生振动松驰，将多余的振动能量传递给介质而降落到该电子的最低振动能级（V=0），后经由内转化及振动松驰而降落到S1电子态的最低振动能级，处于S1电子态的激发分子，其分子内的去活化作用有如下三种途径： 2. 分子产生荧光的机理 （1）发生S1 → S0的辐射跃迁而伴随荧光现象； （2）发生S1 → S0的内转化过程； （3）发生S1 → T1的体系间窜跃。而处于T1态的最低振动能级的激发分子，则可能发生T1 → S0的辐射跃迁而伴随磷光现象，也可能发生T1→ S0的体系间窜跃。 v = 0 isc T1 v = 0 v = 0 2 1 1 2 2 3 1 VR VR VR isc v = 0 S1 S2 S0 1 2 P ic F A1 A2 ic 分子内的光物理过程 A1、A2. 吸收 F. 荧光 P. 磷光 ic. 内转化 isc. 体系间窜跃 VR. 振动松弛 　　　式中K为常数。因此，在低浓度的情况下，荧光物质的荧光强度与浓度呈线性关系。 3. 荧光强度与浓度的关系 对同一物质而言，若abc 1（＜0.05或0.03），即对很稀的溶液，荧光强度F与该物质的浓度c有以下的关系： F = 2.303Фf I0 a?b ? c 式中：Фf－荧光过程的量子效率；I0－入射光强度；a－荧光分子的吸收系数；b－试液的吸收光程。I0 和b不变时： F = K ? C 图A为一极稀的溶液，在入射光I0照射下所发生的荧光均匀地分布在液池中；图B为较浓的溶液，入射光被液池前部的荧光体剧烈吸收后而发生较强的荧光，但在液池中、后部分的荧光体，则因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度大大下降。因而在检测器窗口所探测到的荧光强度反而更低。 4. 偏离线性关系的原因 ⑴内滤效应 I0 It F 图 A It I0 F 图 B 内滤效应示意图 返回 在浓度较高的溶液中，可能发生溶质与溶质间的相互作用，产生荧光物质的激发态分子与其基态分子的复合物或荧光物质的激发态分子与其它溶质基态分子的复合物，从而导致荧光强度的下降。在浓度更大时，甚至可能产生荧光物质基态分子的聚集体，导致荧光强度更严重的下降。 ⑵ 激发态分子与基态分子或其它溶质分子形成复合物，甚至产生荧光物质基态分子的聚集体 假如荧光物质的吸收光谱与它的荧光光谱呈现重叠，便可能发生所发射的荧光被部分再吸收的现象，从而造成荧光强度下降。在这种情况下，浓度增大时会促使再吸收现象的加剧。 ⑶由于再吸收（自吸）现象 二、Varian Cary Eclipse 荧光 分光光度计的特点 由于荧光物质的荧光强度与 激发光源的强度成正比，Eclipse采用了无须预热、耗能12 W 但脉冲输出能量却高达75 KW 的闪烁氙（Xe）灯，并利用电子技术控制,使其仅在发出测量指