结核病实验室诊断现状与进展.ppt

结核病的分子生物学检验 WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008 线性探针分析不能替代目前传统的培养和药敏试验，涂阴标本和XDR-TB的证实都需要进行传统的培养。 结核病的分子生物学检验 （3）Genechip(基因芯片) 基因芯片指采用光导原位合成或微量点样等方法，将核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。 结核病的分子生物学检验 芯片制备质控 芯片制备质控 芯片杂交质控 靶基因扩增质控 阴性对照质控 空白对照质控 结核病的分子生物学检验 结核耐药检测基因芯片 基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。 通 量：两个一线抗结核药 速 度： 6 小时（比传统药敏试验法快 50-100 倍） 灵敏度：103 CFU/反应 特异性：对照设计严谨；自动判读 结核病的分子生物学检验 （4）GeneXpert( 多色巢式定量PCR)检测技术 是一种半定量巢式实时PCR的检测方法，能检测杆菌和利福平耐药性。扩增出ropB基因含有81bp的核心区序列，探针能够区分野生型基因序列与突变型基因序列。 集样本准备、扩增和实时检测于一体。 盒子中含有冻干的试剂，缓冲液和洗涤液。使用6色激光检测装置对靶核酸进行实时检测。 结核病的分子生物学检验 标本类型：临床痰标本，或浓缩处理后的标本（涂阳或涂阴培阳），不能用于用于治疗随访的病人。 ? 对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 ?可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药 ? 两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单 ?不需要生物安全柜，满足涂片试验条件的实验室 结核病的分子生物学检验 结核病的分子生物学检验 （5）分子分型技术 结核分枝杆菌菌株水平鉴定最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用。 基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感染或复发以及国际间传播的研究。 结核病的分子生物学检验 DNA测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐药基因的检测 缺陷：专业设备，专业技术，限制其广泛应用 抛砖引玉 实验耐药=临床耐药？ How does genetic diversity impact a person’s response to drugs? 遗传多态性如何影响人对于药物的反应？ SNP(single nucleotide polymophism)，即单核苷酸多态 是决定个体差异的最主要的遗传基础。 SNP特点 SNP的存在导致生物个体之间大量功能蛋白是不同的，这就导致了对药物反应的不同。 不同基因型个体的用药临床表现 FDA要求在药品说明书中注释相关的基因多态性 利福平能大幅诱导肝药酶，但是对于携带突变的基因型，药酶代谢活力的增加却不明显，野生型则非常明显！这提示，在两药或多药合用时，除诱导剂本身外，有其他药物经由2C19代谢的须格外注意，此时对2C19基因型的检测也非常有意义！ 未来个体化治疗可能需要分子诊断学的帮助来预测临床治疗效果Goofy.Ren menease@ 结核病实验室诊断现状与进展 武汉市结核病防治所 检验科 任易 目 录 1. 结核分枝杆菌的致病性和免疫性 2. 结核病的临床检验 3. 结核病的生化检验 4. 结核病的免疫学检验 5. 结核病的微生物学检验 6. 结核病的分子生物学检验 结核分枝杆菌的致病性和免疫性 （1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核。 （2）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主要与其细胞壁内含大量脂质有关。其主要包括： ①磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关。 ②分枝菌酸：与抗酸染色性有关。 ③索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关 ④硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用。 ⑤ 蜡质D，可刺激机体的迟发型超敏反应。 （3）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫。  结核病的临床检验 现状： 三大常规（血常规、尿常规、大便常规） 血沉 血流变检测 肺结核患者血液粘滞性、凝固性、聚集性均增高，血流缓慢，易于促成肺内微血栓形成