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质谱在蛋白质相互作用研究中的应用光交联 大纲 蛋白质相互作用简介 光交联简介 总结 蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了生物反应网络的重要部分。 蛋白质相互作用简介 Cell 140,805-820, march 19, 2010. TLR2/4 Pathway Notch Pathway Cell. 2009 April 17; 137(2): 216–233. doi:10.1016/j.cell.2009.03.045. Wnt Pathway Pharmacol Ther. 2008 April ; 118(1): 58–81. 这些通路的紊乱会导致疾病的产生，如阿尔茨海默症，帕金森综合症，影响胚胎发育 稳定的相互作用与瞬时的相互作用形成蛋白质相互作用的内涵。 蛋白质相互作用简介 稳定相互作用形成蛋白质复合体（protein complex） 激酶与蛋白的瞬时相互作用 （enzyme-substrate） 蛋白质相互作用方式 常用的蛋白质相互作用研究技术 蛋白质相互作用简介 GST-pull down Co-IP 酵母双杂交 噬菌体展示 荧光共振能量转移（FRET） 常用的蛋白质相互作用研究技术 生物物理学方法 GST-pull-down 融合蛋白可能无功能 假阳性 免疫共沉淀 假阳性；丢失蛋白相互作用信息 不能反应体内真实作用情况 荧光共振能量转移技术 距离限制 融合蛋白可能无功能 分子生物学方法 噬菌体展示技术 有些蛋白不能很好的表达 酵母双杂交 假阳性 In vitro 遗传学技术 合成致死筛选 蛋白选择有局限性 蛋白质相互作用简介 蛋白质相互作用简介 能够最大限度的反映体内蛋白相互作用的真实情况的方法？ 基本原理 将带有光交联基团的非天然氨基酸引入蛋白，在波长为350—365nm的光照射下，和附近蛋白的C-H键形成稳定的共价键。 光交联简介 光交联技术 分类 指定蛋白的光交联 （specific protein photo-cross-linking） 大范围光交联 (broad range photo-cross-linking ) 指定蛋白的光交联( specific protein photo-cross-linking) 光交联简介 定义： 通过将目的蛋白特定位置的氨基酸替换为非天然氨基酸进行光 交联，从而获取相互作用信息。 如何替换？ 蛋白质的合成 指定蛋白的光交联 tRNA ＋ 氨酰tRNA合成酶 tRNA AMP AMP Moleculer biology of the gene, the fifth edition Amino Acid Amino Acid 选取目的蛋白可能的作用位点区域 生物信息学手段 文献调研 作用位点区域的某个氨基酸对应的密码子突变为终止密码子TAG 构建含有点突变目的基因的质粒A 引入特异的tRNA (suppresor tRNA), 特异的氨酰tRNA合成酶（aaRS）及非天然氨基酸（cross-linker）。 常用的非天然氨基酸: p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa), 加入细胞培养基。 对应的tRNA及aaRS： Suppressor tRNATyr （质粒B）， pBpa特异性的大肠杆菌TyrRS突变体（质粒C）。 将质粒A、B、C转入细胞 光照发生交联 350-365nm 指定蛋白的光交联 pBpa 指定蛋白的光交联 Nature Methods. 2005 Mar;2(3):201-6. Epub 2005 Feb 17. 工作流程 指定蛋白的光交联 目的基因点突变，构建真核质粒：GFP, HA, His, Flag tag 三转（triple transfection）:含目的基因的质粒，含aaRS的质粒，含tRNA的质粒 light 350-365nm 收获相互作用蛋白：IP, pull down... SDSFASP MALDI-TOF-MS LC-MS/MS 难点！！ 指定蛋白的光交联 MALDI-TOF-MS Nature Methods. 2005 Mar;2(3):201-6. Epub 2005 Feb 17. 大范围光交联 (broad range photo-cross-linking ) 定义： 将某几种修饰过的带有光合基团的氨基酸非特异性的引入蛋白中，从而实现大范围的光交联。 如何引入？ 合成具有光活性的氨基酸 含有光活性基团：双吖丙啶环，在365nm光照下，生成中性活泼中间体碳烯，与附近的C-H键反