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第五章 体内药物分析 概述 概述 第一节常用体内样品的制备与贮藏 一、体内样品的种类 二、体内样品的采集与制备 三、体内样品的贮存与处理 第二节体内样品分析的前处理 一、体内样品前处理的目的 二、体内样品前处理的方法 (一) 去除蛋白质法 (二) 分离与浓集法 1. 液相萃取法 (1) 溶剂的选取原则 (2) 溶剂的用量 2. 固相萃取法 (1) 固相萃取法的原理 (2) 固相萃取法操作步骤 (3) 注意事项 (4) 自动化固相萃取法 柱切换: 固相萃取-LC/MS/MS 3. 超滤法 (三) 水解法 (四) 化学衍生化法 第三节体内样品分析方法与方法验证 一、分析方法的建立 (一) 分析方法的选择 (二) 分析方法建立的一般程序 二、分析方法的验证 二、分析方法的验证 (一) 特异性 (二) 标准曲线与定量范围 (二) 标准曲线与定量范围 (三) 定量下限 (四) 精密度与准确度 (五) 稳定性 (六) 提取回收率 (七) 分析过程的质量控制 (八) 未知样品浓度超限的处理 (九) 作为药用的内源性物质的测定 (十) 微生物学/免疫学方法的验证 (十一) 名词解释1 (十一) 名词解释2 (十一) 名词解释3 (十一) 名词解释4 Thank You! 分析过程的质量控制 未知样品浓度超限的处理 药用内源性物质的测定 (七) (八) (九) 微生物/免疫学方法的验证 (十) 名词解释 (十一) 分析 其他 比较标准物质与6个不同个体的空白生物介质和QC样品 软电离质谱(LC-MS)介质效应 比较QC样品和至少6个不同个体用药后的实际样品 必要时LC-DAD/MS确证峰的单一/同一 比较待测药物, 同服药物,待测药物的QC样品和添加有同服药物的干扰样品 特异性(specificity), 又称专属性或专一性, 通常与选择性(selectivity)互用 1.内源性物质 2.未知代谢物 3.伍用药物 4.参比方法 参比方法横坐标(x), 拟定方法纵坐标(y), 最小二乘 y=a+bx a恒定干扰 b比例干扰(如, 标记抗原不纯, 交叉免疫) 1. 标准曲线的建立 (二) 少数方法(如,IA)外, 通常为线性模式 线性回归: 最小二乘法或加权最小二乘法 自变量(x)为药物浓度, 因变量(y)为响应信号强度 (1) 系列标准溶液: n≥6(不包括0点); 等比系列(2~3); 通常为100~1000倍 (2) 内标溶液: 浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度 (3) 系列标准样品: 空白生物介质, 加入系列标准溶液 (4) 标准曲线的绘制: 药物浓度, 以单位体积(如血浆)或质量(如肝脏)的生物介质中加入标准物质的量表示 2. 限度要求 通常用至少6个浓度建立标准曲线 非线性相关(如IA)可能需要更多浓度点 定量范围覆盖全部待测样品浓度范围 定量上限(ULOQ)高于用药后的峰浓度(Cmax) 定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20) 标准曲线各浓度点的回归计算值(x’)与标示值(x)之间的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范围之内 最低浓度点的偏差在±20%以内 其余浓度点的偏差在±15%以内 1. 测定法 取同一生物介质,制备至少5个独立的标准样品,其浓度应使信噪比(S/N)大于5,依法进行精密度与准确度验证 定量下限(LLOQ): 标准曲线上的最低浓度点 符合准确度和精密度要求 2. 限度要求 准确度应在标示浓度的80%~120%范围内,相对标准差(RSD)应小于20% 1. 测定法 高中低3个浓度的QC样品, 制备至少5个独立的样品 低:LLOQ的2~3倍;高:ULOQ的80%; 中:几何平均浓度 同法独立测定3天 方法精密度除评价批内(日内)RSD外, 同时还应评价 批间(日间)RSD 2. 限度要求 准确度: 低,80%~120%; 中高, 85%~115% RSD: 低,20%; 中高, 15% 1. 测定法(高低浓度) 室温考察1个工作日(如1,2,4,8或24h) 冷藏(4℃)数个工作日(标准储备液至整个分析完成) 冷冻(-20℃/-80℃)至整个分析完成 冻-融至少经历3个循环 短期稳定性: 在1个分析批内,样品室温等待处理; 处理后溶液在特定(HPLC进室)温度等待进样期间稳定性 长期稳定性: 在整个样品分析期间, 体内样品的长期储藏, 冻融; 以及标准储备液的稳定性 2. 期限要求 短期: 通常1工作日, 不超过3工作日; 长期: 整个分析完成期限 1. 测定法 高中低3个浓度的QC样品, 制备至少5个独立的样品 另取空白生物介质,