血管内皮细胞的分离和培养.doc

 穆 杨, 张彦明 (西北农林科技大学 动物科学与动物医学学院, 陕西 杨凌 712100) 摘 要: 血管内皮细胞位于循环血液与血管壁内皮下组织之间, 是一种多功能的细胞。 本文综述了血管 内皮细胞分离和培养的方法, 并对内皮细胞的鉴定及分离和培养中常见因素进行了介绍, 阐明了血管内 皮细胞分离和培养方法的完善具有广阔的应用前景。 关键词: 血管内皮细胞; 分离; 培养 中图分类号: S852. 2 文献标识码: A 文章编号: 1008- 9381 (2000) 05- 0033- 04 血管内皮细胞 (V a scu la r E n do th e lia l C e ll, V EC ) 位于循环血液与血管壁内皮下组织之间, 裱衬于整个 心血管系统的内表面, 为单层扁平上皮, 是血管壁与 血液之间的分界细胞, 形成心血管封闭系统的形态基 础。 它不仅是一机械屏障, 而且是一种多功能的细 管一端, 固定两端后, 从未结扎的一端注入 0. 25% 的 胰 酶 或 0. 1% 的 胶 原 酶 或 500 U ?mL 的 d isp a se, 37 ℃温浴 15～ 20 m in 后, 就可以收集消化下来的内皮 细胞了。 这一过程说起来简单, 但实际操作中困难却 很多。 首先是采集标本时无菌条件要严格, 如果此步 已经污染, 则后面的实验就谈不上了, 因此采集标本 时 要特别强调无菌概念。 其次是标本保存的时间, J affe 4, 8 最初强调保存时间不得超过 3 h , 后来培养条 件改进, 保存的时间也随之延长。 张宝庚等9 的经验 是保存时间最好不超过 24 h。 目前大多数文献报道 均以不超过 12 h 为准。血管可以保存在 4℃灭菌的磷 酸盐缓冲液 (PB S) 中。 如果条件许可, 血管取下后立 即培养最好, 既利于细胞贴壁, 也利于细胞生长。第三 是消化酶, 分离血管内皮细胞, 除了操作以外, 酶液的 性质是影响分离效果的决定性因素。自从用胶原酶成 功分离脐静脉血管内皮细胞以来, 现已得到广泛应 用, 从分离细胞数量、保持细胞活性和细胞结构完整 性来看, 胶原酶是理想的血管内皮细胞分离酶10 。但 胶原酶价格昂贵, 所以许多学者又研究用胰酶代替胶 胞1 , 除了活跃地参与血小板功能调节、血浆促凝因 子的激活、活化的凝血因子的清除及纤溶过程外, 还 通过 产 生 的 内 皮 素 ( E T )、内 皮 细 胞 衍 生 舒 张 因 子 (ED R F ) 等血管活性物质来调节血管张力, 维持正常 的血液流动性。 一旦 V EC 受损, 必然影响甚至破坏 V EC 正常的生物学功能, 一方面会增加它的通透性 而失去屏障功能, 另一方面会产生较多的促栓物质及 减少抗凝物质的产生, 导致出血及血栓性疾病的发 生2 。 V EC 的重要功能使得它的体外培养研究日益受 到重视。M a ru gam a ( 1963) 首次报道了人 V EC 的培 养, 但有两个问题未得到解决: ①维持内皮细胞的纯 培养, ②鉴定所培养的细胞是内皮细胞3 。后来, J affe 等4 和 G im b ro n e 等5 解决了上述问题, 使得人 V EC 原酶分离血管内皮细胞, 目前已有许多的报道11, 12 。 培 养能够应用于多方面的研究工作中。 目前, 体外 V EC 的培养技术已为阐明许多疾病的病理生理机制 提供了良好的手段6 。 1 V EC 的分离 V EC 最 早 是 从 人 脐 静 脉 中 分 离 出 来 的, 由 于 V EC 在动脉粥样硬化中起着重要的作用, 所以关于 人 V EC 分 离 培 养 的 报 道 很 多, 主 要 以 脐 静 脉 为 来 源。王瑞锦等7 报道了人脐动脉内皮细胞的生长和增 殖。 也有不少关于动物 V EC 培养的报道。 到目前为 止, 虽然各研究者所采用的分离 V EC 的方法在操作 上有差异, 但基本上用的都是酶消化法。具体操作时, 无菌剪取血管标本, 要求长度在 10 cm 以上, 若有分 支, 需在剪断前进行结扎。 先用预先温热的 D 2H an k s 液或 PB S 液中冲洗干净血管内的残血, 然后结扎血 也 有报道用 d isp a se 分离血管内皮细胞的13 。 张宝 庚9 研究表明胰蛋白酶对内皮细胞损伤大, 影响细胞 贴壁和生长, 胶原酶和 d isp a se 均可以, 但 d isp a se 在 收集的细胞数目上不如胶原酶多, 细胞的贴壁和生长 同胶原酶相似。孙继虎等10 研究比较了用单纯胰酶、 全胶原酶和胰酶胶原酶 ( 5∶1) 混合液消化牛主动脉 内皮细胞的能力,