第3章 基因工程制药工艺.ppt

3、无机盐 磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态 基因工程菌生长提供必需的矿物质。 4 选择剂selective agent 维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。 发酵培养过程中质粒容易丢失，使之成为宿主菌。 为了保证质粒的稳定性、不丢失，根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加或缺陷选择剂。 选择剂种类 营养缺陷互补和抗生素抗性。 工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂； 工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。 5 诱导物 诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。 诱导物成为产物表达必不可少的。 Lac启动子表达系统：IPTG诱导。 甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导。 6 培养基组成对质粒稳定性的影响 营养较丰富的培养基，质粒稳定性高于合成培养基； 限制性基质对基因工程菌的比生长速率有不同影响； 大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有一些质粒对氮源、钾、硫等表现不稳定； 对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性； 培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。 二 培养工艺与控制 温度 溶解氧 pH 1 温度对工程菌发酵的影响 生长 大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10℃； 大肠杆菌生长最适温度为37℃，最高温度为45℃； 酿酒酵母生长最适温度为30℃，最高温度为40℃。 生产 生长与生产温度不一致； 较高温度表达包涵体，较低温度下有利于表达可溶性蛋白质； 对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。 温度控制 两段变温发酵培养： 前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度； 后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。 温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37℃，生产期提高温度42℃。 2 pH值对发酵的影响 细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.5～7.5， 真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.0～6.0。 影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。 干扰素是在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。 乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。 pH控制 了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，需要进一步设法控制pH在合适的范围内。 分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。 3 溶解氧控 工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。 从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力。 考虑溶氧对质粒稳定性的影响 通过调节搅拌转速和通气量来调控 三 终点控制 根据目标基因产物的表达模式而定。 适宜的诱导时间：非常重要 诱导物的浓度及其发酵温度：影响表达量，产物存在形式 在生产中应严格控制。 * 武汉科技大学 制药过程与工艺 第3章 基因工程制药工艺 本章内容 3.1 基因工程概述 3.2 基因工程制药微生物表达系统 3.3 基因工程大肠杆菌的构建技术 3.4 基因工程菌的发酵培养与控制 3.5 重组人干扰素生产工艺 概述 20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。 优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足 。 基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程基本过程 基因工程药物制药的主要程序 ⒈目的基因的克隆 ⒉构建DNA重组体 ⒊DNA重组体转入宿主菌 ⒋构建工程菌 ⒌工程菌发酵 ⒍表达产物的分离纯化 ⒎产品的检验等 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定 3.1 基因工程制药微生物表达系统 表达宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素；