第三章 基因工程菌发酵.ppt

第三章 基因工程菌发酵 3.1 概述 3.2 基因工程菌的稳定性 3.3 影响外源基因表达的因素 3.4 基因工程菌发酵过程的工艺控制 3.1 概 述 利用基因工程菌： 生产各种蛋白 改造现有工业生产菌株 基因工程菌发酵水平： 菌种遗传特性 发酵工艺及控制 发酵罐的性能与操作 掌握工程菌的发酵特性、过程控制和优化及放大特点： 才能保证工程菌顺利实现产业化 基因工程菌生产的产品 细胞因子、疫苗、酶 ● 基因工程菌的稳定性因素 ■菌株的构建： 基因剂量 载体性能 宿主特性 启动子 ■发酵工艺条件 培养基 限制性基质 生长速率 ● 基因工程菌的不稳定性 分为脱落性不稳定和结构不稳定 脱落性不稳定： 指由于在基因工程菌的培养过程中发生重组基因的丢失造成的 结构不稳定： 指由于基因的突变造成的 研究基因工程菌的不稳定性 连续培养方式 3.2 基因工程菌的稳定性 1 工程菌稳定性对群体组成变化的影响 ● 工程菌的脱落性不稳定的模型 假定： 质粒丢失的概率为p， 重组菌和质粒丢失的宿主菌的比生长速率恒定（分别为μ﹢和μ－）, aS+X﹢→(2－ p) X﹢ +X－ bS+X－→2X－ 式中S为限制性基质浓度，X﹢和X－分别为带有和丢失质粒菌体的浓度（初始浓度为X0﹢和X0－），a、b为系数 Ollis和Chang提出了丢失了质粒的重组菌在分批培养中的动力学模型（生长、消耗、合成） Lee提出了一个包括脱落性和结构不稳定的结构模型 2 培养条件对稳定性的影响 ● 培养基 ■重组菌在复合培养基中显示较高的稳定性 大肠杆菌HB101(pC170)： μm(h－1) 质粒稳定性 复合培养基 0.508 88% 合成培养基 0.204 295 带质粒pYEαa4的酿酒酵母： 质粒丢失的速率（以葡萄糖为限制性基质） 基本培养基﹥复合培养基 基本培养基： μ的差异 复合培养基： μ的差异及质粒丢失的速率 ■不同的限制性基质对重组菌存在不同的影响 大肠杆菌GM31(pBR325)在连续培养中： 限制性基质 影响 低μ (0.15－1) 高μ (0.55－1) 葡萄糖 10代无四环素抗性 40代开始丢失质粒 氯化铵 100代未失去抗性 10代开始失去耐药性 重组菌GY2345(pBR325)则表现不同 ■质粒在不同的宿主中，有不同的稳定性 质粒pBR325在不同的宿主大肠杆菌中： 限制性基质：葡萄糖、镁盐、磷酸盐 稳定性有很大差异 葡萄糖和磷酸盐限制时最易发生质粒不稳定性 可能是它们提供合成DNA的材料和能量 ● 比生长速率μ 在一定温度和pH下，限制性基质浓度是决定μ的主要因素 重组菌的μ对质粒的稳定性有很大影响 大肠杆菌W3110(pEC901)： 分批补料培养中：不存在质粒的稳定性问题 在连续培养中 低μ (0.302－1)：重组质粒维持20代 高μ (0.