第五章基因治疗.ppt

（3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 3.肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。 基因直接注射法的优点 1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 三、基因转移的靶细胞 靶细胞的选择须考虑： 容易取出和移植。血液系统的细胞、成纤维细胞、成肌细胞； 细胞具有较长的寿命 离体细胞较易受外源基因转化 离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活 体细胞 生殖细胞 目前常用的靶细胞有： 造血细胞 皮肤成纤维细胞 肝细胞 血管内皮细胞 淋巴细胞 肌肉细胞 肿瘤细胞 三、基因干预 Gene Interference 主要干扰特定细胞的mRNA转录和翻译 基因干预的种类： 1.反义RNA (antisense RNA) 2.干扰RNA (RNA interference) 3.核酶 (ribozyme) （一）反义RNA Definition: 反义RNA（Antisense RNA)： 指与靶RNA(或DNA) 具有互补序列的RNA分子。 反义RNA技术 通过体外合成的反义RNA或构建能转录反义RNA的重组DNA质粒转入细胞中，利用碱基互补原理结合细胞中特异mRNA以调控其表达。 Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶Ⅲ 降解； Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译； Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录 1.根据反义RNA的作用机制分为 反义寡聚核苷酸（?类） 与mRNA特异性结合，阻断翻译过程 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 缺点：RNA易降解 （2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用 缺点：细胞内转录的反义RNA量不易控制 2. 反义RNA与基因表达调控 反义RNA的关键技术问题： ?反义RNA进入靶细胞前的降解问题 ?专一性转移问题：如何解决某一组织、器官或系统中部分细胞病变进行专一性转移治疗。 3.受体介导反义RNA转移技术 受受体介导DNA转移方法的启发把DNA换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。 将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。 结合反义RNA，成为ASGP—PL—反义RNA复合物 ASGP-PL－反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。 例： ①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高； ②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。 4.反义RNA的应用（一） 利用反义RNA的原癌基因失活疗法： 阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体mRNA成熟 原癌基因 调控细胞生长，增殖与分化 正常情况下，表达受严格控制 一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌 根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA 相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译位点结合成RNA/RNA双链体 双链体阻止核糖体的结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译 治疗方法 抗HIV-l的作用 ：从翻译水平封闭基因表达，并干扰mRNA的剪切、加工而实现抗病毒作用 反义RNA的应用（二） tat为HIV-l重要的调节基因，编码反式激活因子 Tat蛋白,它能增强HIV-1基因转录起始和延伸的效率. TAR序列是TAT激活HIV基因表达所必需的效应元件。处于LTR的R区内。 Tat结合到TAR的茎环结构上。 Tat可与RNA结合因子一起以复合