第四章 生物制品生.ppt

第四章 生物制品生产基本技术;一、生物制品毒种的标准 生物学性状明显，历史清楚：形态、生理、生化典型、血清学、来源、代数等清楚。 遗传学纯一稳定：稳定纯一的菌种，才能制造出高质量稳定的疫苗。 免疫抗原、反应抗原好：高质量疫苗的基础。 毒力在适当范围内：灭活疫苗应该是强毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。测定毒力要用敏感动物进行。;;;二、强毒种的选育 1、强毒种的用途：灭活疫苗、诊断试剂、抗血清、攻毒试验。 2、强毒种来源：典型传染病分离培养; 保藏中心提供。 3、强毒种分离：;;;三、弱毒种的选育 1、用途：弱毒疫苗，诊断试剂，免疫血清。 2、来源：自然界筛选和人工诱变。 3、弱毒筛选途径：;;自然界弱毒筛选： 同源弱毒—新城疫I系 异源弱毒—火鸡疱疹病毒疫苗，它们都是在自然界寻找发现的。 人工诱变筛选： 化学诱变：洗衣粉、锥黄素、醋酸铊等加入培养基。 物理诱变：高温培养，干燥，紫外线等。 生物诱变：通过钝感动物，细胞以及细胞培养获得。;4、初选的依据： 生物性状改变—猪丹毒杆菌变长丝状，菌落光滑变粗糙。 病毒蚀斑变异。 温度敏感变异。 药物敏感变异 营养变异 宿主变异;第三节 细菌培养技术;一、细菌生长规律与条件;;二、细菌培养的基本技术;（一）细菌分离培养（目的是稀释病料，得到单个典型菌落）。 1、需氧菌分离培养：分段划线、倾注培养。 2、微需氧培养：鸭疫巴氏杆菌，牛布氏杆菌病，猪传染性胸膜肺炎菌等，用蜡烛缸方法。3、厌氧菌培养：用疱肉基，物理除氧气（加氮气，氢气），化学除氧：焦性没食子酸加烧碱。;;;厌氧罐;;;厌氧培养箱;（二）细菌的规模培养 生物制品是产品，一般要大规模培养，才能满足基层需要。 1、菌种接种量：1-3%，过少生长慢，过度带入有害产物多，影响生长。 2、培养时间：菌苗，对数期和稳定期的细菌好；芽孢疫苗：衰老期细菌；外毒素：需要1周时间培养。在培养过程中，如果有少量污染，可以提前灭活终止培养。;②液体静止培养：一般细菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或发酵罐，装入培养基1/2—-2/3量，需氧培养，要5小时摇动一次，增加氧气浓度。培养厌氧细菌，可以装满培养基，上面加少量石蜡油，隔绝空气，下加肝块或肉渣（疱肉基），它们氧化，吸收氧气，达到除氧气目的。液体培养含菌量低，多需要浓缩。;3、培养方法：根据不同制品的性质和要求，选育不同方法。 ①固体表面培养：多用于诊断剂，也有菌苗生产。可随意调节细菌浓度，但操作麻烦，劳动量大。 培养方法有克氏瓶，大平皿，到入菌液，L玻棒刮抹接种，培养后加生理盐水，再用L棒刮洗下细菌混悬液。;;;③液体深层通气培养（发酵罐）：可自动调节温度、氧气、pH、营养、搅拌，注意消泡沫和污染。 ④透析培养：半渗透膜作用，营养可以不断补充，可以提高细菌和毒素含量。 ⑤连续培养：营养不断加入，培养好的细菌不断流出。;KRH-PB-6L 玻璃发酵罐 ;（三）细菌计数技术;②比例法计数（也叫对照法） 如用已知人红细胞为500万/mm3（可以把红细胞0、4%甲醛固定，长期使用），取一环红细胞放在载玻片上，另取一环菌液与红细胞混匀涂片，干燥固定染色，显微镜下检查，如果平均每个视野是一个红细胞，10个细菌，那么，被检查细胞为5000万/ mm3，，1ml是500000万个细菌。;③估计计数法 接种环直径在0、5cm，取一环细菌液，涂抹在载玻片上，大约0、5—1 cm2，干燥固定染色，显微镜检查，如果每个视野平均是1—9个细菌，菌液含量是105-6个/ml，10—99为107-8个/ml，100以上为109-10个/ml，密不可计为1010个以上/ml。;④红细胞计数室法： （细菌量）Y/80X400X稀释倍数X10=细菌数/ mm3，变ml乘1000。（Y是5个中方格细菌总数，乘10是计数室的高度为0、1mm，计数室1mm2，有400个小格，有25个中格，每个中格是16个小格）。该方法多用于计数大的细菌或酵母菌、细胞。;;;2、比浊比色法;②美蓝还原褪色法：含细菌多，使美蓝褪色快。10ml牛奶，加1ml美蓝液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分钟，细菌多于2000万/ml，20-2小时，为400—2000万；2----5、5小时为50—400万；5、5小时以上，为少于50万/ml，为一级牛奶；如果用于细菌苗，应先用已知细菌找出规律。 ;3、活菌计数：;②平板表面涂布法：先做好营养琼脂平板，将不同稀释度菌液0、1ml加上，玻璃棒刮匀，37度24h培养，计算菌落乘稀释度乘10=菌数/ml ③微量滴板法：