2第二章 微生物生态学研究方法.ppt

第二章、微生物生态学研究的基本方法;; 标记类型; 微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容。;20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。;虽然可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态学 的发展起了很重要的作用。 采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少 （不到1 % ）。 Amann 等人报道在自然环境样品中可培养的微生物占总的微生物数量的比例范围从0.001%（海水）到0.3%（土壤）。 不能全面地反映微生物区系组成状况，烦琐、耗时。;BIOLOG鉴定系统;3、生物标记物法（Biomakers ）;醌指纹法(Quinones Profiling);磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。;4. ERIC (肠杆菌基因间保守重复序列) -PCR指纹图谱技术;;;Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。;E1: 5-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3 E2: 5-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3;;5. 以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法;Diversity estimation based on molecular markers;实验原理;16S ribosomal RNA;环境16S rDNA文库的构建与组成分析技术;1990年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性。 16S rDNA文库中的蓝藻种类与培养出来的蓝藻很不一致； 发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群； 与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生物多样性； 这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。 ;构建环境16S rDNA文库的方法;;;阳性克隆筛选的过程： 1.Amp抗性，挑选出含有质粒的克隆 2.蓝白斑筛选，挑出带有插入片段的克隆 3.PCR筛选，挑出带有正确长度插入片段的克隆;ARDRA分型与测序;克隆文库的统计分析;Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP);变性梯度凝胶电泳（DGGE）;原理;显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。 MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个解链区域。;不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。;然而，当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。;;当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用PCR 扩增的16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。;40%;;荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization ） ;利用荧光标记的寡聚核苷酸探针标记16S rRNA或23S rRNA，然后进行原位杂交探测，可以在原位状态下探测特定生物细胞，并可提供部分关于形态、空间分布等方面的信息。 ;常用荧光原位杂交探针一览表;FISH常用荧光素;10 ?m;Microbial community determined by Fluorescent In-Situ Hybridization (FISH);基于16S rRNA基因的分类微阵列－－ 高通量的分析微???物群落结构，成为检测复杂环境微生物群落结构的重要工具。 lab-on-a-chip ：这种 lab-on-a-chip被设计成可以分离各种微生物细胞、裂解后纯化DNA 或 mRNA，这个研究领域对于更深理解微生物的群落结构具有重要影响。 ;未培养微生物资源的开发：;生 物 圈;针对未培养微生物的培养技术研究;模拟原位生态条件的培养技术;Science 2002;土壤宏基因组（Metagenome）计划;reconstruction of near-complete ge