w13章遗传病诊断.ppt

;;;;;;;;;五、 基因诊断 gene diagnosis 采用分子生物学方法在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。 可基因诊断的疾病约1000种？;（一）基因诊断的基本技术 *包括： 分子杂交技术；聚合酶链式反应(PCR)技术 * DNA序列测定技术； 基因芯片技术 ; ;4）基因诊断方法 （1）斑点杂交法 又称等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针杂交。 用人工合成的20个碱基左右长度的ASO探针，一般要合成两种探针：正常探针，突变探针。 将待测的细胞或DNA直接点在硝酸纤维膜或尼龙膜上，将标记有同位素（或其他标记）的变性探针与其进行杂交，通过放射自显影，判断受检基因的有无以及基因的拷贝数，进行基因诊断。 ;ASO斑点杂交;;;（3）northern印迹杂交（northern bloting) 是RNA杂交的常用方法。 原理：应用特异性基因探针分析基因的转录，转录量的变异，mRNA的大小。 过程:提取总RNA… p193 (4)western印迹杂交(western bloting) 是在蛋白质水平检测或研究基因表达与功能的方法。 过程:提取蛋白质…p194 (5)原位杂交（前述） ;2.聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，PCR） 聚合酶链反应技术是在体外迅速的选择性扩增特定的靶DNA的方法。 PCR的原理： （1）合成引物：按靶DNA片段的5`和3`端的碱基顺序各合成两条引物（长约20个碱基的寡核苷酸）； （2）建立反应体系：将待测DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP），引物和耐热DNA聚合酶（Taq 酶）； ;（3）反应液进行热 循环：每一周期经过 变性（92-95℃）， 复性（40-60℃）和 延伸（65-72℃）三 个阶段产生倍增的DNA。 一般进行20-40个周期。;PCR相关技术及应用： （1） PCR-ASO ：PCR/等位基因特异性寡核苷酸探针杂交 PCR扩增 用ASO探针杂交 （2）PCR-RFLP：PCR-限制性片段长度多态性连锁分析 PCR扩增 限制酶酶切 电泳 （3）RT-PCR：反转录PCR 反转录酶 合成cDNA （4）多重PCR：用两对以上引物 （5）PCR-SSCP：PCR-单链构象多态性分析 在突变点附近设计引物—PCR扩增—突变DNA构象变化—电泳分离—DNA测序 （6）PCR-DGGE （7）定量PCR ;PCR-SSCP;PCR-SSCP; 3.DNA测序技术(DNA sequenceing Maxan和Gilbert首先建立了化学方法，Sanger建立了DNA测序的酶学方法。 DNA自动测序法：以不同荧光色素标记的四种不同脱氧核苷酸为原料进行酶促合成反应，经过凝胶电泳分离，应用激光分析及计算机处理就能直接读出碱基顺序。而且测序的长度可以达到1000bp以上。 ; DNA测序（DNA Sequencing)是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。;4.基因芯片技术 （gene chip) 　基本原理：核酸杂交 基本过程：将许多特定 的寡核苷酸片段或基因片 段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，得出所要的信息。; ;（二）基因诊断的途经和方法(略） 1.途径 1)直接诊断 —— 检测突变基因 直接诊断是直接检测致病突变的基因。它通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因有无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病。 当致病基因的某种突变类型与发病有直接的因果关系,或者对致病基因以及分子机制已完全了解,或者对致病基因以及分子机制部分了解但已知其中规律,可应用此途径。 ;2) 间接诊断 —— 基因连锁分析 当致病基因虽然已知但其异常尚属未知或突变类型较多时；或致病基因本身尚属未知时，但被检测基因有紧密连锁的DNA多态标记，可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。 连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMP－FLP等技术均可用于连锁分析。 ;2.基因诊断的方法选择： 各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传病也可以有不同的基