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DNA定点突变实验 标签： DNA 定点突变 DNA定点突变可以：（1）研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性；（2）改造启动子或者DNA作用元件；（3）提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。 详细 实验方法 Dpn I法 实验方法原理 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。多点突变的原理是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，Dpn I消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒（因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。 实验材料 DNA 试剂、试剂盒 pyrobest DNA聚合酶DpnI去离子水BSA大肠杆菌DH5a菌株 仪器、耗材 PCR仪离心管移液枪枪头枪头盒水浴锅灭菌锅培养箱 实验步骤 一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。 二、反应1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。 2. 反应体系： （1）10x pyrobest Buffer： 5 ul （2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul （3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul （4）primer 1 (125 ng) ：1 ul （5）primer 2 (125 ng) ：1 ul （6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul （7）加无菌蒸馏水至50ul. 三、产物沉淀纯化1. 加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。 2. 70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用 DpnI酶切）。 四、DpnI酶切1. 酶切体系（1）Buffer ：2 ul （2）BSA（100╳）：0.2 ul （3）DNA ：x ul （4）DpnI：0.5 ul （5）加无菌去离子水至 20 ul。 2. 30℃酶切 1~4 h。3. 65℃水浴15min 终止反应。 五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。 六、测序验证 展开 注意事项 1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。 2. Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChangereg、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChangereg、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。 3. DpnI处理的时间最好