与耐药机制有关药敏试验的规范化-陈东科.ppt

与耐药机制有关药敏试验的规范化 卫生部北京医院 陈东科 前言 细菌耐药已成为一个全球性问题，已对人类健康构成严重威胁。耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。因此，检测细菌耐药机理是当今细菌学的一个最重要的课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。  在细菌耐药机理的检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛应用。但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。真正应用到临床微生物实验室的试验方法，要求操作简便、重复性好，结果准确、可靠，试验成本不能太高。 一、革兰阳性球菌耐药机制 实验室检测项目 （1）青霉素酶的检测 （2）MRS (甲氧西林耐药葡萄球菌 ) （3） VISA / VRSA (万古霉素耐药金黄色葡萄球菌 ) （4）肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药 （5）HLAR (高水平氨基糖苷类耐药 ) （6）VRE (万古霉素耐药肠球菌 ) （7） PRSP (青霉素耐药肺炎链球菌 ) （8）克林霉素诱导试验 （一）青霉素酶的检测 检测青霉素酶方法有碘量法、酸量法和显色头孢菌素法等，临床应用较多的是显色头孢菌素法。其原理是将受菌株与头孢硝噻吩（Nitrocefin）作用一定时间后，如受试菌株产生青霉素酶，则可水解头孢硝噻吩的β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。 葡萄球菌可诱导β-内酰胺酶的检测： 如果青霉素对葡萄球菌的MIC≤ 0.12μg/ml 或者抑菌环直径≥29 mm，应该对其进行可诱导β-内酰胺酶的检测。将待检细菌传代至BAP或者MHA琼脂平板上，用OX或FOX纸片作为诱导剂（具体方法同纸片药敏试验），过夜培养，检测抑菌圈周边细菌的产酶情况。用头孢硝噻吩纸片法（Cefinase）进行测试。测试时用1滴无菌水将Cefinase 纸片湿润，将抑菌圈边缘的受试菌直接涂于经湿润后的Cefinase 纸片，1h内观察其颜色反应，纸片变红色为诱导试验阳性，不变色（黄色）为阴性。可诱导β-内酰胺酶检测阳性的菌株，应报告对不耐酶青霉素耐药。 (二)甲氧西林耐药葡萄球菌（MRS）检测 检测mecA 和其表达的青霉素结合蛋白2a(PBP2a，也称为PBP2‘)是预报葡萄球菌对甲氧西林耐药最准确的方法，它也被用于证实从严重感染病人分离的葡萄球菌纸片扩散法药敏试验结果。携带mecA 基因或产PBP2a（mecA 基因表达产物）的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林/甲氧西林耐药。不携带mecA 或不产PBP2a 菌株应报告对苯唑西林敏感。由于罕见非mecA 基因介导的苯唑西林耐药机制，在纸片扩散法确定为苯唑西林耐药时，应加测苯唑西林MIC，若MIC≥4μg/ml，即使mecA 基因和PBP 2a 检测为阴性，也应报苯唑西林耐药。可用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。 1. 苯唑西林纸片筛选试验 方法：使用含1μg苯唑西林纸片（而不是甲氧西林或萘夫西林）来检测葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。用直接菌落悬液法制备的接种物（0.5麦氏比浊浓度菌液）接种MH琼脂平板， 待琼脂表面的水份干后，贴苯唑西林纸片，于33℃-35℃孵育24h，测量抑菌圈直径。 结果判断：按NCCLS/CLSI解释标准判断结果，金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径≤10mm为耐药，≥13mm为敏感。除路邓葡萄球菌外的其它凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径≤17mm为耐药，≥18mm为敏感。 注意事项 （1）在透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长，如有说明耐药。 （2）试验温度超过35℃不能检测MRS。 （3）纸片扩散法结果如有疑问，必须进行mecA 基因或PBP2a 测定、头孢西丁纸片试验、苯唑西林MIC 试验或苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否为MRS 菌株，选择其中一种试验结果进行报告。 2. 苯唑西林-盐琼脂筛选试验 方法： 试验用的MH琼脂中含苯唑西林6μg/ml，并添加有氯化钠（4% W/V--0.68 mol/L）。直接菌落悬液获得0.5 麦氏浊度。进行试验时，使用1μl 接种环蘸取菌液，在平板上涂成直径10 到15mm 斑点。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成类似大小斑点或划满四分之一区。将琼脂平板置于35℃，孵育24小时后检查有无细菌生长，任何生长都表示对苯唑西林耐药（如图）。 注意事项： 为从凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药菌株，需要将琼脂平板孵育48小时。 3. 头孢西丁纸片法　 方法： 应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含30μg头孢西丁纸片， 35