基因操作-核酸杂交.ppt

蒋小英 jiangxy@mail.xjtu.edu.cn 遗传学与分子生物学系 西 安 交 通 大 学 医 学 院 第一节 核酸的理化性质 第二节 基因的获取 第三节 基因的克隆 第四节 克隆基因的表达 第五节 基因结构的分析与改造 第六节 基因的拷贝数分析 第七节 基因表达的分析 第八节 基因功能的分析 基因操作 核酸分子杂交技术 PCR技术 基因工程 核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下重新组成的新的双链分子——杂交分子。 DNA-DNA杂化双链 核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待测样品中存在与否 是基因芯片技术的基础 核酸分子杂交技术 第一节 核酸杂交的基本理论 第二节 核酸探针 第三节 核酸分子杂交技术 第一节 核酸杂交的基本理论一、变性与复性  核酸的一般理化性质 核酸的酸碱及溶解度性质 有磷酸基及碱基,为两性大分子,但偏于酸性 可与金属离子成盐,不溶于乙醇或异丙醇 核酸的高分子性质 粘度: DNARNA dsDNAssDNA 核酸的紫外吸收：OD260 DNA的变性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。 解链温度（融解温度，Tm）(melting temperature)： 使50%的DNA发生变性时的环境温度。其大小与G+C含量有关. DNA的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。 DNA的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。 2. 影响复性的因素 核酸杂交：不同来源的两条核酸单链由于具有互补序列，在一起复性时，互补序列配对，形成杂化分子。 二、影响杂交的因素 1. 核酸分子的浓度和长度 注意： ①待测核酸顺序与探针顺序同源性高的杂交，用水溶液时取68℃，用50%甲酰胺溶液时取40℃。 第二节 核酸探针 问题1： 如何显示探针与另一条单链杂交了？探针为什么要标记？ 问题2： 杂交时应考虑哪些问题？ 杂交的探针(probe) 1、用于杂交待检核酸的单链核酸片段，其末端用荧光素、放射性同位素等标记。 2、探针的意义：从众多的核酸分子中挑出与探针互补的核酸序列。 第二节 核酸探针 一、探针的选择原则 1. 基因组DNA探针 从基因组DNA文库中选取某一基因片段 2. cDNA探针（complementary DNA） 3. RNA探针：检测DNA和mRNA 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少, 未杂交探针可用RNase 降解，减少本底的干扰。 三、探针设计原则： ①长度：10~50bp 四、探针标记物的选择 理想的标记物： 探针的标记与检测常用的放射性标记物 /非放射性标记 （一）常用的放射性标记物 常用探记探针的同位素： 32P、3H、35S、14C、125I、131I 3. 探针标记的方法 ①缺口平移法（nick translation） 实质：用[α-32P]dNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记。 切口平移法DNase?I： 适当温度(14～16℃)下， 在DNA双链上随机形成单链切口。 DNA聚合酶I： 有5’?→?3’?核酸外切酶 及5’?→?3’聚合酶的活性。 方法 （1）按下列配比混合： 未标记的dNTP 10μl 10×切口平移缓冲液5μl 待标记的DNA 1μg [α-32P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl E.coli DNA聚合酶Ⅰ 4U DNA酶Ⅰ1μl 加水至终体积 50μl； （2）置于15℃水浴60min； （3）加入5μl EDTA终止反应； （4）反应液中加入醋酸铵，使终浓度为0.5mol/L，加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。 注意事项：