在合适的时间点检测凋亡APOPTOSIS.PDF

在合适的时间点检测凋亡 TERRI SUNDQUIST, M.S., RICH MORAV EC, B.S., A NDREW NILES, M.S., MA RTHA O BRIEN, PH.D., A ND TERRY RISS, PH.D., PROMEGA CORPORATION S 凋亡是指与细胞死亡相关的一系列的特定的细胞形态学变化。我们列出了一些影响因素，这些因素可能会对凋亡相关的生物化学事件产生的时 I S 间产生影响，并着重阐述在某适合的时间区段内监测这些生化事件的重要性。 O T P O P 引言 过锚定蛋白V 的结合而被检测到)、多聚[ADP-核糖]聚合酶 A 细胞死亡会发生一系列的作用通路不同的细胞形态 (PARP) 的降解和核DNA断裂。 学和生物化学变化，包括凋亡、坏死和自我吞噬( 1) 。 生物化学事件发生的精确时间取决于凋亡途径。另 “凋亡”这一名词最先由Kerr等人(2)创建，用来描述 外，凋亡被诱导后，检测不同的生化事件或活性的时间 具有确定的形态学变化的细胞死亡，包括细胞皱缩、 点往往也是不同的。例如，使用抗Fas单克隆抗体(mAb) 染色质浓集、核膜的完整性消失、胞膜空泡化(plasma 处理J urkat 细胞，凋亡的外部通路即被激活，Fas 受体 membrane blebbing) 、最后形成凋亡小体。虽然凋亡 形成三聚体，引发构象变化，促使死亡诱导信号复合体 指的是纯粹的形态学变化，但是在这些形态学变化中常 (DISC)形成。使用抗Fas单克隆抗体处理Jurkat细胞后， 伴随着生物化学反应的发生。这些生化反应包括启始 caspase-8活性在处理后3小时就达到峰值，而caspase- Caspase酶和效应Caspase酶的激活、线粒体细胞色素 3/7活性在测量的7小时内逐渐增加(图1)。PARP在处理后 C的释放、质膜磷脂酰丝氨酸的外化，多聚[A DP-核糖] 6小时达到降解高峰，而晚期事件-DNA 断裂，直到处理 聚合酶(PARP) 的降解和核DNA的断裂。 后9小时仍没有达到峰值(图2)。在最佳测量时间段之前或 这些生物化学事件并不都是凋亡所特有的，不会 之后对这些事件进行检测，都可能导致测量的信号与背景 在所有的凋亡细胞或凋亡的所有阶段都发生，也不会在 ( 比较1小时和7小时时溶剂对照组和抗Fas单克隆抗体处 所有凋亡诱导剂刺激时都发生。这些生化事件发生的时 理组的caspase-8活性，图1)相比太弱或没有，从而导致 程也有很大差别，并受许多因素的影响，包括细胞系或 结论错误，认为该处理方式不会诱导细胞凋亡。因此，根 组织、凋亡诱导剂、药物浓度或刺激强度和暴露时间。 据经验确定在什么时候目标活性出现峰值是非常关键的。 因此，有策略地选择检测哪些生化事件就变得十分关 所以，研究者应进行预实验来确定某一检测的最佳时间， 键，通过检测这些生化事件可以证实细胞的死亡是由于 凋亡引起的，同时，还可以了解细胞死亡的动态过程。 本文中我们主要讨论了在适宜的时间段内检测这些生化 事件的重要性，确保这些变化被捕捉到，而不致错过。 我们也列出了一些可能会影响相关生化事件的检测时限 的因素。 细胞凋亡过程中的生化事件的时限 通常，细胞凋亡是通过外部的或内部固有的途 径而进行的。外部(受体介导的)途径涉及受体结合、 激活起始caspase酶(caspase-8) 、caspase-8继而激 活cas pase-3或者切割Bcl-2 家族成员Bid ，从而放大 cas pas e- 3 的激活效应；Bid 的切割导致细胞色素C 漏出、蛋白复合体(也称作凋亡复合体) 的形成，以及